TLRs介導(dǎo)的GLUTs和MCTs表達(dá)變化對(duì)神經(jīng)元存活的影響及其機(jī)制.pdf

1、葡萄糖是神經(jīng)元活動(dòng)的主要燃料，神經(jīng)活動(dòng)引起能量需求增加主要通過葡萄糖的氧化代謝來滿足。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是通過其細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporters，GLUTs)家族實(shí)現(xiàn)的。在哺乳動(dòng)物大腦利用葡萄糖的過程中，主要是GLUT1和GLUT3在發(fā)揮作用。大腦神經(jīng)元主要表達(dá)GLUT3、GLUT6和GLUT8。胰島素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或H2O2等可以通過PI3K-AKT、MAPKs、cAMP或NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、途徑調(diào)節(jié)GLUT3的表達(dá)和葡萄糖的攝取。近年來的研究表明，神經(jīng)活動(dòng)期間神經(jīng)元能夠攝取膠質(zhì)細(xì)胞釋放的乳酸作為其主要能量代謝底物。糖酵解產(chǎn)生的乳酸通過細(xì)胞膜上的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporters，MCTs)轉(zhuǎn)運(yùn)出膠質(zhì)細(xì)胞，使神經(jīng)元很容易通過自身膜上的MCTs將乳酸攝入，以滿足神經(jīng)元活動(dòng)期間增加的能量需求。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）表達(dá)MCT1、MCT2和MCT4，

3、其中MCT2主要表達(dá)于神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素可通過PI3K-Akt和mTOR/S6K途徑增加MCT2的表達(dá)。曾有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，當(dāng)神經(jīng)元處于富含葡萄糖和乳酸的環(huán)境中時(shí)，會(huì)優(yōu)先使用乳酸作為主要的氧化底物。該結(jié)果表明即使是在血糖正常的情況下乳酸也可優(yōu)先于葡萄糖作為腦代謝的燃料。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是一種重要的模式識(shí)別受體(patternrecognition receptor，P

4、RRs)，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associatedmolecular pattern，PAMPs)，構(gòu)成機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，人和小鼠的CNS也表達(dá)TLRs，它們?cè)谝幌盗蠧NS感染和非感染疾病中起著十分重要的作用。最近幾年越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)TLR家族的多個(gè)成員，TLR3和TLR8首先分別被發(fā)現(xiàn)在人神經(jīng)元細(xì)胞系和小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達(dá)，正常小鼠神經(jīng)元表達(dá)TLR1-8和TLR

5、10-13的mRNA和TLR2、TLR6的蛋白;病毒感染后神經(jīng)元細(xì)胞的TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，表明TLRs在神經(jīng)元病毒感染中起著十分重要的作用。有報(bào)道表明激活TLR9能夠使神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的能量底物減少并使AMP/ATP比值增加，進(jìn)而激活A(yù)MP激活的蛋白激酶(AMPK)，從而使神經(jīng)元的缺氧性應(yīng)激耐受力增加，并且沒有典型的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生;在骨髓來源的脂肪細(xì)胞中，激活TLR3或TLR4能夠?qū)е翯LUT4表達(dá)

6、下降并降低胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和增加脂肪分解。另有報(bào)道表明，神經(jīng)元能量缺失后能夠?qū)е缕銽LR2和TLR4的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，這些結(jié)果表明TLRs在參與細(xì)胞的能量代謝方面起著十分重要的作用。病毒感染神經(jīng)元后，在其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中就合成了dsRNA和ssRNA，這些dsRNA和ssRNA能夠作為病原相關(guān)分子模式而被神經(jīng)元的TLR3、TLR7和TLR8等識(shí)別，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。本課題中我們用ply(I:C)(一種合成的dsRNA

7、，模擬病毒dsRNA)和R848（一種合成的化合物，TLR7和TLR8的特異性配體）分別模擬dsRNA和ssRNA刺激體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，初步研究了dsRNA與TLR3相互作用或ssRNA與TLR7/8相互作用是否會(huì)影響神經(jīng)元GLUTs和MCTs的表達(dá)，從而影響神經(jīng)元對(duì)葡萄糖和乳酸的利用，并且是否因此影響神經(jīng)元的存活及其相關(guān)機(jī)制，以期探討病毒感染神經(jīng)元過程中其dsRNA和ssRNA通過TLRs介導(dǎo)造成的神經(jīng)病理?yè)p傷機(jī)制，為神經(jīng)系統(tǒng)病毒

8、感染性疾病的防治研究提供新的理論依據(jù)。
　　 第一部分、TLRs激活對(duì)體外胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活的影響
　　 目的:建立胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系，用poly(I:C)或R848處理胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，觀察TLR3或TLR7/8激活是否會(huì)影響胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的存活。
　　 方法:選取孕16-18 d的C57BL/6野生型孕鼠和TLR3-/-型孕鼠，脫頸處死后取出胎鼠大腦皮質(zhì)部分，剪碎、消化、吹打后制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于

9、預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板上，用Neurobasal培養(yǎng)基（含2％B27、1％胎牛血清和1％谷氨酰胺）體外培養(yǎng)8d成為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，以MAP2作為神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，以DAPI標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)所有表達(dá)MAP2的細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞核的個(gè)數(shù)，計(jì)算出神經(jīng)元細(xì)胞所占比率，具體計(jì)算公式為MAP2標(biāo)記細(xì)胞個(gè)數(shù)/DAPI染色的細(xì)胞個(gè)數(shù)，以此檢測(cè)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元純度;用poly(I:C)刺激培養(yǎng)8天后的神經(jīng)元，按照對(duì)照組

10、、不同濃度poly(I:C)刺激分組，在作用不同時(shí)間后，通過MTT法檢測(cè)野生型和TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活性;通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)野生型和TLR3-/-型神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。用R848刺激野生型神經(jīng)元，用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活性，與對(duì)照組即僅DMSO處理組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞純度達(dá)到90％以上，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。poly(I:C)和R848分別刺激神經(jīng)元后，都能夠?qū)е乱吧吞ナ笃?/p>

11、質(zhì)神經(jīng)元活性顯著降低，而poly(I:C)不能使TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的活性顯著降低。FCM結(jié)果也表明， poly(I:C)刺激神經(jīng)元24h后，野生型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的早期凋亡和晚期凋亡比對(duì)照組增多，而TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的刺激組和對(duì)照組無明顯差異。
　　 結(jié)論:poly(I:C)能夠通過激活TLR3影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活，并且導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，而R848也能通過激活TLR7/8導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

12、>　　 第二部分、TLRs介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs表達(dá)變化
　　 目的:研究poly(I:C)激活TLR3和R848激活TLR7/8是否會(huì)影響胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞GLUTs和MCTs mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 方法:以體外培養(yǎng)8d、純度達(dá)到90％以上的神經(jīng)元細(xì)胞作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組、20μg/ml終濃度的poly(I:C)處理不同時(shí)間(1h、4h、10h、15h)組、不同濃度的poly(I:

13、C)（10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）刺激相同時(shí)間(10h)組、30μg/ml終濃度的R848處理不同時(shí)間(1h、4h、12h、15h)組、不同濃度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同時(shí)間(12h)組等，然后抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過Real-timePCR法檢測(cè)GLUTs和MCTs的mRNA表達(dá)變化;再按照對(duì)照組、20μg/ml終濃度的poly(I:C)處理不同時(shí)間(12h、24h、36h)

14、組、不同濃度的poly(I:C)(10μg/ml、20μg/ml、40μ g/ml)刺激相同時(shí)間(24h)組、30μg/ml終濃度的R848處理不同時(shí)間(12h、24h、36h)組、不同濃度的R848（5μg/ml、30μg/ml、60μg/ml）刺激相同時(shí)間(24h)組，收集細(xì)胞抽提蛋白質(zhì)，通過Western blotting檢測(cè)GLUTs和MCTs蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，poly(I:C)刺激神經(jīng)元細(xì)胞不

15、同時(shí)間，TLR3-/-型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs的mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化;野生型胎鼠神經(jīng)元細(xì)胞的GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA在刺激10h后表達(dá)下降，20μg/ml poly(I:C)刺激神經(jīng)元24h后GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表達(dá)水平明顯下降，且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，GLUT3、GLUT8和MCT2的蛋白表達(dá)水平下降更為明顯;而用R848刺激野生型胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞后能夠?qū)е翯LUT3和MCT2

16、mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，并且隨著刺激濃度的增加而增加。
　　 結(jié)論:poly(I:C)刺激神經(jīng)元細(xì)胞后能夠?qū)е翯LUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下降，而R848刺激神經(jīng)元細(xì)胞后能夠上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、MCT2的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 第三部分、TLRs介導(dǎo)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GLUTs和MCTs表達(dá)變化的相關(guān)分子機(jī)制初探
　　 目的:探討poly(I:C)激活TLR3和R848激活T

17、LR7/8影響神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUT3、GLUT8和MCT2的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)8d純度達(dá)到90％以上的神經(jīng)元細(xì)胞作為研究對(duì)象，按照對(duì)照組、20μg/ml終濃度poly(I:C)刺激組、30μgl終濃度R848刺激組、20μg/ml終濃度poly(I:C)+PDTC/bx-795（或PDTC/bx-795）刺激組分組，Real-time PCR檢測(cè)poly(I:C)或R848刺激后神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IFN-β、

18、TNF-α、IL-6 mRNA的變化;ELISA檢測(cè)IFN-β、TNF-α、IL-6蛋白水平;Western Blot檢測(cè)TLR3信號(hào)通路相關(guān)分子TBK1、IRF3、IRF7、NF-κB、p38、ERK、JNK等的磷酸化水平。Real-time PCR和Western Blot方法檢測(cè)分別加入兩種信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理再用poly(I:C)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2的mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:p

19、oly(I:C)刺激胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元10h后，細(xì)胞的IFN-β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)，IL-6和IFN-β蛋白表達(dá)增加，R848刺激胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元12h后，細(xì)胞的IFN-β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)，但是只有IFN-β蛋白表達(dá)增加。Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)poly(I:C)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞TBK1、IRF3、IRF7、p65的磷酸化水平上調(diào)，然而p38、ERK和JNK的磷酸化水平未發(fā)生變化。分

20、別用NF-κB的抑制劑PDTC和TBK1的抑制劑bx-795處理細(xì)胞，然后用poly(I:C)刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用PDTC預(yù)處理后能夠部分抑制poly(I:C)下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2表達(dá)的作用，而用bx-795預(yù)處理對(duì)poly(I:C)下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞GLUT3、GLUT8和MCT2表達(dá)的作用沒有影響。
　　 結(jié)論:TLR3可能通過NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUT3、GLUT8和MCT2，導(dǎo)致神