RNA干擾α-突觸核蛋白對多巴胺能神經元的影響及其機制.pdf

1、帕金森病是最早出James Parkinson醫(yī)生于1817年報告并因此而得名的一種神經系統(tǒng)疾病。其臨床癥狀有靜止性震顫、肌肉強直、隨意運動減少和正常的姿勢平衡反射喪失等。
　　 PD的病因尚不清楚，目前認為與線粒體功能異常、氧化應激等因素密切相關。Schapira等首次報道PD病人的黑質內線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性降低，大量的文獻報道PD病人的血小板、淋巴細胞及肌肉組織內都存在線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性降低。因此PD的發(fā)病伴隨著線

2、粒體功能異常。而且用復合物Ⅰ的抑制劑魚藤酮處理后，動物表現出PD樣行為學改變，并且黑質紋狀體內出現類似PD的病理變化。研究表明PD病人細胞內的氧化產物如活性氧簇增多，而抗氧化物如谷胱苷肽水平降低，引起PD病人的黑質內多不飽和脂肪酸的濃度下降、脂質氧化的標志物丙二醛和4-羥基壬烯醛濃度升高、可溶性蛋白的羰基修飾水平明顯提高并且PD病人腦內細胞核DNA和線粒體DNA中的脫氧鳥苷被氧化成8-羥脫氧鳥苷，這表明PD病人腦內的脂質、蛋白質及DNA

3、都處于氧化應激狀態(tài)。
　　 PD的主要病理變化包括黑質內多巴胺神經元死亡和殘留神經元胞漿內蛋白積聚出現嗜酸性包涵體即路易小體。組織學發(fā)現LB的纖維成分主要由泛素、神經絲和α-突觸核蛋白組成。α-突觸核蛋白是一種突觸前神經末梢蛋白,其生理作用尚不明確。據報道它可能參與調節(jié)細胞的生長和分化、突觸可塑性和遞質的釋放及參與某些信號傳導通路的調節(jié)。但α-突觸核蛋白基因SNCA的錯義點突變A53T、A30P、E46K都可以導致家族性帕金森病

4、癥狀。另外SNCA的二倍重復突變體和三倍重復突變體也可以引起早發(fā)性遺傳性帕金森癥狀，而且在三倍重復突變體家族比二倍重復突變體家族發(fā)病年齡早、進程快，這說明α-突觸核蛋白表達量也與PD密切相關。許多文獻報道非家族性PD病人的腦內也出現α-突觸核蛋白表達升高及蛋白的異常積聚。體內和體外的研究也表明，過度表達α-突觸核蛋白會造成神經元死亡。這些都提示α-突觸核蛋白在PD的發(fā)病中起重要作用，抑制其表達可能會阻止或延緩多巴胺能神經元的死亡。

5、>　　 RNA干擾是一種在轉錄后水平有效抑制基因表達的方法?；瘜W合成的小干擾RNA是一種常用的介導RNAi的雙鏈RNA，與載體攜帶的短發(fā)夾RNA結構相比作用時間短暫、轉染率低。Fountaine等利用化學合成的siRNA可以減少α-突觸核蛋白表達并能抵抗1-甲基-4-苯基吡啶離子引起的細胞活性下降，但是否影響了細胞線粒體的功能、凋亡調控因子表達及細胞內氧化應激水平未見報道。
　　 本研究用采用了分子克隆、基因沉默和細胞培養(yǎng)等技

6、術，構建出靶向α-突觸核蛋白的shRNA重組質粒載體，轉染細胞并篩選出穩(wěn)定轉染的細胞。利用Mpp+制作PD細胞模型，利用RT-PCR、MTT分析、流式細胞分析和Westernblotting、DCFH-DA法等方法探討了干擾α-突觸核蛋白表達對帕金森病細胞模型的形態(tài)改變、線粒體的功能、Bcl-2/Bax表達及細胞內的ROS和GSH水平的影響。以期為PD的基因治療提供可靠的實驗依據，為PD的治療提供新思路。
　　 第一部分 RNA

7、i表達載體的構建及沉默效應的鑒定
　　 目的：應用基因工程技術構建靶向α-突觸核蛋白基因的shRNA表達載體，并將其轉染SH-SY5Y細胞系，鑒定其沉默基因的效果。
　　 方法：
　　 1.構建靶向α-突觸核蛋白基因的shRNA表達載體。根據表達載體的要求和文獻報道的有效siRNA的序列，設計合成插入載體的shRNA序列，以一對無關序列的寡核苷酸作為陰性對照。將單鏈DNA退火連接，并將退火片段與線性化的質粒載體p

8、Genesil-2.2連接，形成重組質粒pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA。將重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選卡那霉素抗性的陽性克隆，提取質粒。對構建的表達載體質粒pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA分別經SalI酶切電泳鑒定及DNA測序。
　　 2.重組質粒轉染SH-SY5Y細胞系，鑒定基因沉默效果。將pGen

9、esil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA通過陽離子脂質體的介導轉入SH-SY5Y細胞內，利用G418抗性篩選穩(wěn)定轉染的細胞。轉染了pGenesil-α-syn-shRNA的細胞為干擾組，轉染了pGenesil-scrambled shRNA的細胞作為載體對照組，未轉染任何載體的細胞為正常對照組。提取各組細胞蛋白，利用Western blotting檢測各組細胞中α-突觸核蛋白的表達水平。

10、　　 結果：
　　 1.構建的表達載體pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA經SalI酶切、瓊脂糖凝膠電泳后觀察到一條約620bp的條帶。DNA測序結果證實目的序列準確無誤，與設計結果完全相符。
　　 2.經G418篩選，可獲得穩(wěn)定轉染的pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA的陽性細胞。經Western blotti

11、ng檢測，載體對照組的細胞與正常對照細胞α-突觸核蛋白的表達相似，而干擾組細胞內表達的α-突觸核蛋白明顯降低。
　　 結論：靶向α-突觸核蛋白的表達載體pGenesil-α-syn-shRNA經酶切鑒定及DNA測序證實構建成功，轉染細胞后可以穩(wěn)定地干擾SH-SYSY細胞內α-突觸核蛋白的表達。
　　 第二部分 RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細胞線粒體功能障礙的抑制作用
　　 目的：研究RN

12、A干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細胞凋亡、線粒體功能障礙和Bcl-2/Bax下降的作用。
　　 方法：
　　 1.采用MTT法，檢測三組細胞：正常未轉染的細胞、轉染pGenesil-scrambled shRNA的細胞及轉染pGenesil-α-syn-shRNA的細胞在不含MPP+或含500μM MPP+的培養(yǎng)基中孵育24 h后的細胞活力。
　　 2.用Hoechst33258對細胞進行染色，

13、觀察正常對照組或干擾組細胞在MPP+處理后細胞核的形態(tài)變化。
　　 3.用流式細胞技術檢測正常對照組或干擾組的細胞在MPP+處理后線粒體膜電位的變化。
　　 4.Western blotting檢測MPP+處理后正常對照組或干擾組細胞漿內細胞色素c和細胞內Bcl-2、Bax蛋白表達。
　　 結果：
　　 1.MPP+處理24 h后正常對照組、載體對照組和干擾組細胞的活力都顯著降低，與MPP+處理的正常組細

14、胞相比，經MPP+處理的載體對照組無顯著差異，而干擾組細胞能顯著抵抗MPP+引起的細胞活力下降。
　　 2.Hoechst33258染色顯示正常對照組細胞在MPP+處理24 h后有30.2+1.6％細胞核呈凋亡狀態(tài)，而干擾組細胞與MPP+共孵育后僅有14.2±1.3％細胞凋亡，與前者相比有明顯差異。
　　 3.MPP+作用后，正常對照組低線粒體膜電位的細胞占41.0±1.5％，在MPP+處理的干擾組此比例僅為13.6±1

15、.2％，兩者有顯著差異。
　　 4.MPP+引起細胞質中的細胞色素c明顯升高，在干擾組細胞中這種升高明顯減弱。
　　 5.正常對照細胞在MPP+處理后Bcl-2/Bax比值僅為原來的35.5±3.8％，而干擾組細胞在MPP+處理后Bcl-2/Bax比值約為85.2±3.0％，比前者明顯升高。
　　 結論：干擾α-突觸核蛋白表達可能通過上調Bcl-2/Bax比值、抵抗線粒體膜電位下降、抑制線粒體內細胞色素c釋放進胞

16、漿，從而保護線粒體的正常功能，抵抗MPP+引起的細胞凋亡。
　　 第三部分 RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細胞內氧化應激的抑制作用
　　 目的：研究RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細胞內ROS和GSH水平變化的影響作用。
　　 方法：
　　 1.將DCFH-DA裝載到細胞，利用多功能酶標儀檢測熒光強度來顯示細胞內的ROS水平。
　　 2.用GSH分析試

17、劑盒來檢測細胞內的GSH水平。
　　 結果：
　　 1.MPP+處理后，SH-SY5Y細胞內ROS水平升高至正常對照組的234.7±3.8％，干擾組細胞經MPP+處理后，ROS水平升高至149.2±8.2％，但與MPP+處理的正常對照細胞相比，ROS水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.SH-SY5Y細胞經500μM MPP+處理后，細胞內的GSH水平降低為正常對照細胞內的56.0±3.5％。干擾組細胞在M

18、PP+處理后，細胞內的GSH水平為61.1±3.2％，與MPP+處理的正常對照細胞相比，GSH水平顯著升高。
　　 結論：干擾α-突觸核蛋白表達能抑制MPP+引起的ROS水平升高和GSH水平降低。這可能是干擾α-突觸核蛋白表達能抑制MPP+細胞毒性的一個原因。
　　 小結：
　　 本課題應用基因工程技術構建的shRNA表達質粒能有效地干擾SH-SY5Y細胞內α-突觸核蛋白表達并可抑制MPP+引起的細胞凋亡和形態(tài)學