TLR7-8對神經(jīng)元細胞表達GLUTs和MCTs的影響及其機制.pdf

1、現(xiàn)代社會人口老齡化現(xiàn)象越來越嚴重，老年性癡呆(senile dementia)、帕金森?。≒D）、腦卒中等疾病的發(fā)病率都有所升高，此外腦部的感染性疾病如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染造成的癡呆癥等，也嚴重危害著人類生命。腦部疾病與腦的能量代謝異常有密切關(guān)系，應用各種先進技術(shù)研究腦的能量代謝與腦部疾病的關(guān)系已成為當今腦部疾病研究的熱點之一。
　　葡萄糖是大腦供能的主要來源之一，也是大腦必需的能量底物，葡萄糖進入腦實質(zhì)后，通過循環(huán)提供

2、能量給神經(jīng)元及其他多種細胞。腦部的能量代謝活動主要是通過葡萄糖的氧化代謝來實現(xiàn)的，葡萄糖的轉(zhuǎn)運依賴于細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT)來完成。另外糖酵解產(chǎn)生的乳酸也可以為大腦供能，乳酸的轉(zhuǎn)運依靠細胞膜上的單羧酸轉(zhuǎn)運體(MCT)來完成。研究發(fā)現(xiàn)，在血漿葡萄糖正常的時候乳酸優(yōu)先被利用為大腦供應能量，與葡萄糖相比乳酸作為腦能量代謝的首選燃料，但是具體的作用機制尚未研究清楚。神經(jīng)元上可檢測到多種轉(zhuǎn)運體，包括GLUT3、GLUT6、GLUT8和MC

3、T2，他們分別通過不同的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)葡萄糖和乳酸的攝取。
　　Toll樣受體(TLRs)在天然免疫應答中扮演著重要的角色，并且在進化中高度保守。在哺乳動物中，TLRs能夠識別保守的病毒或者細菌的結(jié)構(gòu)成分也就是病原相關(guān)分子模式(PAMPs)。TLRs識別配體后引起相關(guān)信號通路的活化，釋放促炎性細胞因子，最終清除入侵的病原體。盡管在哺乳動物中TLRs主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，但是在神經(jīng)元細胞中也存在著某些TLRs，并發(fā)揮其他重要作

4、用。在大腦表達的TLRs家族成員主要有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9。在果蠅胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育中，如突觸發(fā)生、神經(jīng)軸突的形成、軸突（輸出端）方向等方面TLRs也扮演著重要的角色。在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，TLRs在小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形細胞中表達，并且在感染和組織損傷中高表達，TLRs在神經(jīng)退行性變中可以活化炎性細胞。在鼠的胚胎發(fā)育過程中，TLR3抑制端腦的神經(jīng)祖細胞的增殖并介導軸突的生長。TLR2

5、和TLR4在成年的海馬神經(jīng)形成中也起到重要作用。TLR7在鼠腦發(fā)育中也有表達，且主要是在胚胎早期。TLR8在鼠腦的發(fā)育過程中動態(tài)表達，主要集中于神經(jīng)元和軸突。用TLR8的配體刺激之后，能抑制神經(jīng)突的生長并且介導凋亡。TLR9活化后影響神經(jīng)元細胞內(nèi)AMP/ATP值及對缺氧的耐受。在脂肪細胞中TLR3或TLR4活化后調(diào)節(jié)GLUT4的表達，影響葡萄糖攝取和脂肪分解。本實驗室以往的研究發(fā)現(xiàn)，主要識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)的TLR3在神經(jīng)元

6、細胞的能量代謝中扮演重要的角色。TLR7和TLR8作為主要識別病毒單鏈RNA（ssRNA）的受體，是否也參與神經(jīng)細胞的能量代謝及具體的信號通路是什么尚未見報道。因此，本課題主要研究的是TLR7/8活化對神經(jīng)元細胞表達在能量代謝中起關(guān)鍵作用的GLUTs和MCTs有何影響，并探討其相關(guān)機制，以期從新的角度探討腦內(nèi)表達TLR7/8在腦疾病中的作用。
　　一、TLR7/8活化對神經(jīng)元細胞活性的影響
　　為了探討TLR7或TLR8活化

7、對神經(jīng)元細胞存活狀態(tài)的影響，本實驗首先建立原代胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系，用TLR7的特異性配體Loxoribine或TLR7/8配體CL075（3M-002，優(yōu)先作用于TLR8）刺激所培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞，觀察作用后的不同時間點細胞活性及凋亡情況。結(jié)果顯示，建立的體外培養(yǎng)體系中神經(jīng)元細胞純度大于90％，能夠用于后續(xù)的實驗。Loxoribine或CL075(3M-002)刺激所培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞后，經(jīng)CCK8法檢測顯示，兩種配體都能夠引起

8、神經(jīng)元細胞活性顯著降低，流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)分析結(jié)果也表明，與對照組相比神經(jīng)元的凋亡增多。進一步合成了TLR7的干擾小RNA(siRNA)，分別用兩種配體刺激經(jīng)siRNA干擾的皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，結(jié)果顯示同對照組相比細胞的活性沒有發(fā)生明顯的變化，F(xiàn)CM結(jié)果也顯示神經(jīng)元的凋亡沒有顯著增加。因此，第一部分實驗結(jié)果表明，TLR7/8活化能夠降低神經(jīng)元細胞的活性，并且導致神經(jīng)元細胞出現(xiàn)凋亡。
　　二、TLR7/

9、8對神經(jīng)元細胞表達GLUTs和MCTs的影響
　　引起神經(jīng)元細胞活性降低或凋亡的因素很多，如線粒體途徑、caspase途徑等，本實驗主要是探討TLR信號通路在腦神經(jīng)元細胞能量代謝中的作用。因此，在這部分實驗中，主要研究了TLR7的特異性配體Loxoribine與TLR7/8配體CL075(3M-002)是否對神經(jīng)元細胞表達GLUTs與MCTs產(chǎn)生影響。
　　首先用Loxoribine或CL075(3M-002)與神經(jīng)元細胞共

10、孵育一定時間后，收集細胞抽提RNA和蛋白質(zhì)來檢測MCTs和GLUTs的表達。實時定量聚合酶鏈反應(Real-time qPCR)結(jié)果顯示，Loxoribine能夠下調(diào)MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA的表達水平，但是CL075(3M-002)可使MCT2和GLUT3 mRNA表達水平上調(diào)。免疫印跡(WB)實驗結(jié)果顯示，Loxoribine作用于細胞后MCT2、GLUT3和GLUT8的蛋白表達水平同mRNA表達一致，但是CL075

11、(3M-002)刺激細胞后僅引起MCT2蛋白表達增加。皮質(zhì)神經(jīng)元細胞預先用TLR7 siRNA處理后，再以Loxoribine刺激，同對照組比較MCT2、GLUT3和GLUT8表達水平?jīng)]有明顯差異;CL075(3M-002)作用于細胞后，與對照組相比MCT2表達水平無明顯變化。這些實驗結(jié)果表明，Loxoribine刺激神經(jīng)元細胞后，能夠下調(diào)神經(jīng)元細胞中MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA和蛋白表達水平;而CL075(3M-002)

12、僅影響MCT2的表達水平。在神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖和乳酸進行能量代謝過程中，TLR7和TLR8活化都發(fā)揮一定的作用。
　　三、TLR7/8影響神經(jīng)元表達GLUTs和MCTs的機制初探
　　為了探討TLR7/8活化后影響神經(jīng)元細胞表達GLUTs和MCTs的相關(guān)機制，用Real-time qPCR法檢測了Loxoribine或CL075(3M-002)與神經(jīng)元細胞共孵育后干擾素β(IFN-β)、干擾素α（FN-α）、腫瘤壞死因子α

13、(TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6) mRNAs表達的變化;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測了神經(jīng)元細胞分泌上述細胞因子水平的變化;以western blot檢測TLR7/8信號通路相關(guān)分子干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、p65等的磷酸化水平;用Real-time qPCR和western blot方法檢測加入NF-κB信號通路抑制劑吡咯烷銨(PDTC)預處理再用Loxor

14、ibine或CL075(3M-002)刺激后，神經(jīng)元細胞GLUTs和MCTs mRNAs和蛋白表達變化。
　　結(jié)果顯示，Loxoribine或CL075(3M-002)可使神經(jīng)元細胞表達TNF-α、IFN-α、IFN-β及IL-6 mRNAs有不同程度的上調(diào)，但僅使IFN-β和IL-6的分泌水平增加。經(jīng)TLR7的特異性配體Loxoribine處理后，神經(jīng)元細胞IRF3、IRF7及p65的磷酸化水平上調(diào)。用NF-κB信號通路抑制劑P

15、DTC處理細胞，然后用Loxoribine刺激，結(jié)果顯示PDTC可以部分抑制Loxoribine下調(diào)神經(jīng)元細胞MCT2、GLUT3和GLUT8表達的作用;而經(jīng)過PDTC預處理神經(jīng)元細胞后，CL075(3M-002)僅對MCT2的上調(diào)有一定的抑制作用，對GLUT3的表達無影響。這部分的實驗結(jié)果提示，TLR7可能通過MyD88依賴的信號通路活化NF-κB來抑制神經(jīng)元細胞表達MCT2、GLUT3和GLUT8，導致神經(jīng)元細胞內(nèi)能量代謝障礙，進而