TLR7-8對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUTs和MCTs的影響及其機(jī)制.pdf

1、現(xiàn)代社會(huì)人口老齡化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，老年性癡呆(senile dementia)、帕金森病（PD）、腦卒中等疾病的發(fā)病率都有所升高，此外腦部的感染性疾病如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染造成的癡呆癥等，也嚴(yán)重危害著人類生命。腦部疾病與腦的能量代謝異常有密切關(guān)系，應(yīng)用各種先進(jìn)技術(shù)研究腦的能量代謝與腦部疾病的關(guān)系已成為當(dāng)今腦部疾病研究的熱點(diǎn)之一。
　　葡萄糖是大腦供能的主要來(lái)源之一，也是大腦必需的能量底物，葡萄糖進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)后，通過(guò)循環(huán)提供

2、能量給神經(jīng)元及其他多種細(xì)胞。腦部的能量代謝活動(dòng)主要是通過(guò)葡萄糖的氧化代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)的，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)來(lái)完成。另外糖酵解產(chǎn)生的乳酸也可以為大腦供能，乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)依靠細(xì)胞膜上的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCT)來(lái)完成。研究發(fā)現(xiàn)，在血漿葡萄糖正常的時(shí)候乳酸優(yōu)先被利用為大腦供應(yīng)能量，與葡萄糖相比乳酸作為腦能量代謝的首選燃料，但是具體的作用機(jī)制尚未研究清楚。神經(jīng)元上可檢測(cè)到多種轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括GLUT3、GLUT6、GLUT8和MC

3、T2，他們分別通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)葡萄糖和乳酸的攝取。
　　Toll樣受體(TLRs)在天然免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色，并且在進(jìn)化中高度保守。在哺乳動(dòng)物中，TLRs能夠識(shí)別保守的病毒或者細(xì)菌的結(jié)構(gòu)成分也就是病原相關(guān)分子模式(PAMPs)。TLRs識(shí)別配體后引起相關(guān)信號(hào)通路的活化，釋放促炎性細(xì)胞因子，最終清除入侵的病原體。盡管在哺乳動(dòng)物中TLRs主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，但是在神經(jīng)元細(xì)胞中也存在著某些TLRs，并發(fā)揮其他重要作

4、用。在大腦表達(dá)的TLRs家族成員主要有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9。在果蠅胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育中，如突觸發(fā)生、神經(jīng)軸突的形成、軸突（輸出端）方向等方面TLRs也扮演著重要的角色。在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，TLRs在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞中表達(dá)，并且在感染和組織損傷中高表達(dá)，TLRs在神經(jīng)退行性變中可以活化炎性細(xì)胞。在鼠的胚胎發(fā)育過(guò)程中，TLR3抑制端腦的神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖并介導(dǎo)軸突的生長(zhǎng)。TLR2

5、和TLR4在成年的海馬神經(jīng)形成中也起到重要作用。TLR7在鼠腦發(fā)育中也有表達(dá)，且主要是在胚胎早期。TLR8在鼠腦的發(fā)育過(guò)程中動(dòng)態(tài)表達(dá)，主要集中于神經(jīng)元和軸突。用TLR8的配體刺激之后，能抑制神經(jīng)突的生長(zhǎng)并且介導(dǎo)凋亡。TLR9活化后影響神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP值及對(duì)缺氧的耐受。在脂肪細(xì)胞中TLR3或TLR4活化后調(diào)節(jié)GLUT4的表達(dá)，影響葡萄糖攝取和脂肪分解。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究發(fā)現(xiàn)，主要識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)的TLR3在神經(jīng)元

6、細(xì)胞的能量代謝中扮演重要的角色。TLR7和TLR8作為主要識(shí)別病毒單鏈RNA（ssRNA）的受體，是否也參與神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝及具體的信號(hào)通路是什么尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題主要研究的是TLR7/8活化對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)在能量代謝中起關(guān)鍵作用的GLUTs和MCTs有何影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，以期從新的角度探討腦內(nèi)表達(dá)TLR7/8在腦疾病中的作用。
　　一、TLR7/8活化對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響
　　為了探討TLR7或TLR8活化

7、對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞存活狀態(tài)的影響，本實(shí)驗(yàn)首先建立原代胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系，用TLR7的特異性配體Loxoribine或TLR7/8配體CL075（3M-002，優(yōu)先作用于TLR8）刺激所培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，觀察作用后的不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性及凋亡情況。結(jié)果顯示，建立的體外培養(yǎng)體系中神經(jīng)元細(xì)胞純度大于90％，能夠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。Loxoribine或CL075(3M-002)刺激所培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞后，經(jīng)CCK8法檢測(cè)顯示，兩種配體都能夠引起

8、神經(jīng)元細(xì)胞活性顯著降低，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)分析結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比神經(jīng)元的凋亡增多。進(jìn)一步合成了TLR7的干擾小RNA(siRNA)，分別用兩種配體刺激經(jīng)siRNA干擾的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，結(jié)果顯示同對(duì)照組相比細(xì)胞的活性沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，F(xiàn)CM結(jié)果也顯示神經(jīng)元的凋亡沒(méi)有顯著增加。因此，第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR7/8活化能夠降低神經(jīng)元細(xì)胞的活性，并且導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　二、TLR7/

9、8對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUTs和MCTs的影響
　　引起神經(jīng)元細(xì)胞活性降低或凋亡的因素很多，如線粒體途徑、caspase途徑等，本實(shí)驗(yàn)主要是探討TLR信號(hào)通路在腦神經(jīng)元細(xì)胞能量代謝中的作用。因此，在這部分實(shí)驗(yàn)中，主要研究了TLR7的特異性配體Loxoribine與TLR7/8配體CL075(3M-002)是否對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUTs與MCTs產(chǎn)生影響。
　　首先用Loxoribine或CL075(3M-002)與神經(jīng)元細(xì)胞共

10、孵育一定時(shí)間后，收集細(xì)胞抽提RNA和蛋白質(zhì)來(lái)檢測(cè)MCTs和GLUTs的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time qPCR)結(jié)果顯示，Loxoribine能夠下調(diào)MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA的表達(dá)水平，但是CL075(3M-002)可使MCT2和GLUT3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)。免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Loxoribine作用于細(xì)胞后MCT2、GLUT3和GLUT8的蛋白表達(dá)水平同mRNA表達(dá)一致，但是CL075

11、(3M-002)刺激細(xì)胞后僅引起MCT2蛋白表達(dá)增加。皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞預(yù)先用TLR7 siRNA處理后，再以Loxoribine刺激，同對(duì)照組比較MCT2、GLUT3和GLUT8表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異;CL075(3M-002)作用于細(xì)胞后，與對(duì)照組相比MCT2表達(dá)水平無(wú)明顯變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Loxoribine刺激神經(jīng)元細(xì)胞后，能夠下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞中MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA和蛋白表達(dá)水平;而CL075(3M-002)

12、僅影響MCT2的表達(dá)水平。在神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和乳酸進(jìn)行能量代謝過(guò)程中，TLR7和TLR8活化都發(fā)揮一定的作用。
　　三、TLR7/8影響神經(jīng)元表達(dá)GLUTs和MCTs的機(jī)制初探
　　為了探討TLR7/8活化后影響神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)GLUTs和MCTs的相關(guān)機(jī)制，用Real-time qPCR法檢測(cè)了Loxoribine或CL075(3M-002)與神經(jīng)元細(xì)胞共孵育后干擾素β(IFN-β)、干擾素α（FN-α）、腫瘤壞死因子α

13、(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6) mRNAs表達(dá)的變化;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)了神經(jīng)元細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子水平的變化;以western blot檢測(cè)TLR7/8信號(hào)通路相關(guān)分子干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、p65等的磷酸化水平;用Real-time qPCR和western blot方法檢測(cè)加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑吡咯烷銨(PDTC)預(yù)處理再用Loxor

14、ibine或CL075(3M-002)刺激后，神經(jīng)元細(xì)胞GLUTs和MCTs mRNAs和蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果顯示，Loxoribine或CL075(3M-002)可使神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-α、IFN-β及IL-6 mRNAs有不同程度的上調(diào)，但僅使IFN-β和IL-6的分泌水平增加。經(jīng)TLR7的特異性配體Loxoribine處理后，神經(jīng)元細(xì)胞IRF3、IRF7及p65的磷酸化水平上調(diào)。用NF-κB信號(hào)通路抑制劑P

15、DTC處理細(xì)胞，然后用Loxoribine刺激，結(jié)果顯示PDTC可以部分抑制Loxoribine下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞MCT2、GLUT3和GLUT8表達(dá)的作用;而經(jīng)過(guò)PDTC預(yù)處理神經(jīng)元細(xì)胞后，CL075(3M-002)僅對(duì)MCT2的上調(diào)有一定的抑制作用，對(duì)GLUT3的表達(dá)無(wú)影響。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TLR7可能通過(guò)MyD88依賴的信號(hào)通路活化NF-κB來(lái)抑制神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)MCT2、GLUT3和GLUT8，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，進(jìn)而