肝細(xì)胞生長因子對神經(jīng)元缺氧-復(fù)氧損傷的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)對大腦皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。 方法：取原代培養(yǎng)的Sprague-Dawley大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，以LDH漏出率作為細(xì)胞損傷指標(biāo)、MTT比色法檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，研究缺氧、低(無)糖、缺氧/復(fù)氧對神經(jīng)元的影響，建立體外缺氧/復(fù)氧損傷模型。在此基礎(chǔ)上，通過LDH漏出率的測定、MTT比色法、流式

2、細(xì)胞術(shù)、Hoechst 33258染色法、RT-PCR、Westem blotting的方法研究HGF對皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷的影響及其與MEK/ERK1/2、PI-3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bcl-xL和Bax的關(guān)系。利用基因芯片技術(shù)研究HGF對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元缺氧信號通路的影響。用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證這些差異表達(dá)基因中的6個(gè)(Myb12、Cygb、Birc5、Cdc42、IL1β、NOS2)，

3、并通過Western blotting檢測ItGF對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元Cygb和NOS2蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果： 1.缺氧、低(無)糖及缺氧/復(fù)氧對神經(jīng)元的影響 (1)MTT比色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，缺氧1h，神經(jīng)元細(xì)胞活力即降低，而LDH漏出率從缺氧4h開始增高，且隨缺氧時(shí)間的延長，細(xì)胞活力呈降低的趨勢，LDH漏出率呈增高的趨勢。 (2)低糖(葡萄糖濃度為2.5mmol/L)、無糖處理均誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，

4、且無糖組的損傷較低糖組更為嚴(yán)重。 (3)缺氧條件下培養(yǎng)，各組對缺氧耐受性由高到低排列依次為正常糖組>低糖組>無糖組。 (4)神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧與單獨(dú)缺氧比較，細(xì)胞活力降低，LDH漏出率和細(xì)胞凋亡率均增高，且隨復(fù)氧時(shí)間的延長(0～24h)，細(xì)胞活力呈下降趨勢，LDH漏出率及細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢。 2.HGF對神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷的影響 (1)用RT-PCR、Westem blotting的方法，在體外培養(yǎng)10

5、d的大腦皮層神經(jīng)元和生后10d大鼠的大腦皮層組織均檢測到c-MetmRNA和c-Met蛋白的表達(dá)。 (2)HGF對缺氧8h/復(fù)氧12h(H8R12)損傷神經(jīng)元的影響：HGF降低LDH漏出率的效應(yīng)從20ng/ml開始出現(xiàn)，在60ng/ml達(dá)最高峰；增強(qiáng)細(xì)胞活力和抗凋亡效應(yīng)均從10ng/ml開始出現(xiàn)，也是在60ng/ml達(dá)最高峰。此外，在缺氧處理前12h、缺氧處理前1h、缺氧即刻及復(fù)氧即刻加入終濃度為60ng/ml的HGF，均使H8

6、R12損傷神經(jīng)元LDH漏出率降低，細(xì)胞活力增高，細(xì)胞凋亡率降低。其中缺氧處理前1h加入HGF在上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，增強(qiáng)細(xì)胞活力的效應(yīng)為最強(qiáng)。c-Met抑制劑SU11274(5μmol/L)明顯阻斷了HGF的神經(jīng)保護(hù)作用。 (3)HGF對氧糖剝奪2h/再灌注24h(OGD2R24)損傷神經(jīng)元的影響：HGF增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低LDH漏出率和細(xì)胞凋亡率的效應(yīng)均從20ng/ml開始出現(xiàn)，在80ng/ml達(dá)最高峰。此外，在缺氧處理前12h、缺

7、氧處理前2h、缺氧即刻及復(fù)氧即刻4個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入終濃度為80ng/ml的，HGF，均使細(xì)胞活力增高，細(xì)胞凋亡率降低。在復(fù)氧即刻加入HGF，對OGD2R24損傷神經(jīng)元的LDH漏出率無明顯影響，其余三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LDH漏出率均降低。缺氧處理前2h加入HGF，在上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中降低LDH漏出率和增強(qiáng)細(xì)胞活力的效應(yīng)均為最大。c-Met抑制劑SU11274(5μmol/L)顯著抑制了HGF介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。 3.HGF對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元的保

8、護(hù)作用與ERK1/2、PI-3K/Akt通路及凋亡相關(guān)分子的關(guān)系 (1)Western blotting的結(jié)果顯示，HGF激活大腦皮層神經(jīng)元MEK/ERKl/2與P13-K/Akt信號通路。 (2)MTT比色實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258染色的結(jié)果顯示，用MEK的抑制劑，U0126(500nmol/L)明顯阻斷了HGF對H8R12損傷神經(jīng)元的促細(xì)胞存活和抗凋亡效應(yīng)。P13-K的抑制劑，LY294002(LY

9、，10μmol/L)預(yù)處理抑制了HGF介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。使用上述濃度的兩種抑制劑(不加HGF)對常氧條件下培養(yǎng)及H8R12處理神經(jīng)元的細(xì)胞活力和凋亡率均無明顯影響。 (3)RT-PCR和Western blotting的結(jié)果顯示，H8/R12損傷后，皮層神經(jīng)元Bcl-2、Bcl-xL的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)， BaxmRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而Bax蛋白的表達(dá)無明顯變化。用HGF(60ng/ml)預(yù)處理明顯上調(diào)了缺氧/復(fù)

10、氧損傷神經(jīng)元Bel-2、Bcl-xL的mRNA和蛋白表達(dá)水平，但對Bax mRNA和蛋白的表達(dá)無顯著影響。 4.HGF對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元缺氧信號通路的影響 (1)對缺氧信號通路基因芯片顯示的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，涉及代謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架、凋亡等方面。 (2)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，神經(jīng)元H8/R12損傷后Myb12mRNA、Cygb mRNA、Birc5 mRNA表達(dá)下調(diào)，Cdc42 m

11、RNA、Nos2mRNA、IL1βmRNA表達(dá)上調(diào)；HGF(60ng/ml)預(yù)處理能明顯抑制H8R12損傷神經(jīng)元Myb12 mRNA、Cygb mRNA、Birc5 mRNA水平的降低，以及Cdc42 mRNA、NOS2 mRNA、IL1β mRNA水平的增高。 (3)Western blotting的結(jié)果顯示，H8R12損傷后，神經(jīng)元Cygb蛋白表達(dá)水平明顯降低，NOS 2蛋白表達(dá)顯著增高，HGF預(yù)處理能明顯上調(diào)H8/R12損

12、傷神經(jīng)元Cygb蛋白的表達(dá)，下調(diào)NOS2蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論： 1.缺氧、低(無)糖可引起皮層神經(jīng)元損傷，且與持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)，皮層神經(jīng)元對缺氧、低(無)糖十分敏感。 2.低(無)糖能加重缺氧導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元損傷，呈一定的時(shí)效依賴性，無糖對缺氧的耐受性低于正常糖和低糖。 3.缺氧后復(fù)氧可加重缺氧引起的皮層神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，呈一定的時(shí)效依賴關(guān)系。 4.c-Met受體存在于大腦皮層組織和體外培養(yǎng)的

13、大腦皮層神經(jīng)元。 5.HGF對體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷具有直接的保護(hù)作用，并呈一定的量效和時(shí)效關(guān)系。 6.MEK/ERK1/2通路的激活在HGF對皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)效應(yīng)中起重要作用，P13-K/Akt通路也參與了這一效應(yīng)。 7.Bcl-2和Bcl-xL可能參與了HGF對皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。 8.初步明確皮層神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷后，缺氧信號通路相關(guān)基因的變化規(guī)律。