靈芝與羅布麻提取物對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及其機制的離體研究.pdf

1、腦缺血后的病理生理過程復雜,腦缺血再灌注損傷級聯(lián)反應其中一環(huán)是細胞凋亡,抑制神經細胞凋亡有利于缺血性腦血管病的治療。中藥活性成分的多樣性常常與損傷級聯(lián)的復雜性具有針對效應。靈芝和羅布麻是我國傳統(tǒng)中藥的珍品,國內外的研究表明:靈芝多糖、靈芝甾醇及羅布麻總黃酮可能通過抑制氧化應激對腦缺血有保護作用。氧化應激反應是導致凋亡的最重要途徑之一。因此,本文研究靈芝及羅布麻提取物抗凋亡作用及其可能機制。
　　 第一部分:靈芝提取物(Ganod

2、ermalucidiumextract,GLE)對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及其機制研究
　　 目的研究GLE對原代大鼠皮層神經元OGD損傷模型的影響,在細胞水平探討GLE神經保護作用的科學機制。
　　 方法新生SD大鼠的皮層神經元原代培養(yǎng)至第7天,GLE預處理神經元OGD模型。選取OGD復氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作為觀察點,觀察GLE干預后對各個時間點的細胞形態(tài)學、細胞毒作用、細胞線粒體

3、活性、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的表達量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影響。細胞形態(tài)學采用倒置相差顯微鏡觀察;細胞毒作用采用LDH釋放測定:細胞線粒體活性采用XTT檢測分析;細胞凋亡率采用流式細胞技術檢測:蛋白質表達水平分析采用westernblot。
　　 結果一.光鏡形態(tài)學觀察:OGD復氧后3h開始,神經元損傷進行性加重,OGD復氧后72h時損傷最明顯,GLE能減輕缺氧復氧

4、對神經元的損傷。二.LDH的釋放量在OGD復氧后3h開始有所增高,隨復氧時間的延長進一步增高,復氧后72h達到最高值。各濃度GLE組在OGD復氧后3h、6h、12h、24h、48h和72h均能明顯減少LDH的釋放,有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05),并隨著濃度的增加及用藥時間的增加而作用增強。三.OGD復氧后3h細胞線粒體活性開始逐漸降低,隨復氧時間的延長進一步下降,復氧后72h達到最低值,各濃度GLE組能增強細胞活力,并隨著濃度的增加及

5、用藥時間的增加而作用增強。四.OGD復氧后24h時,模型組平均凋亡率較正常組顯著增高(P＜0.001),各濃度GLE組平均凋亡率較模型組顯著降低(P＜0.001)。OGD復氧后72h時,各濃度GLE組平均凋亡率明顯低于模型組(P＜0.001),濃度越高作用越強。五.OGD復氧后24h時,westernblot結果顯示模型組caspase-3,caspase-8caspase-9蛋白表達增高;各濃度的GLE均能抑制caspase-3,ca

6、spase-8的表達;10μg/ml的GLE能抑制caspase-9蛋白的表達,但0.1μg/ml、1μg/m1GLE均未能抑制caspase-9的表達。另外,模型組Bcl-2蛋白明顯下降,Bax蛋白表達明顯增高,GLE各濃度組的Bcl-2蛋白的表達下降不明顯;各濃度的GLE組均能明顯抑制Bax蛋白的表達。
　　 結論一.GLE對OGD皮層神經元損傷有顯著的神經保護作用;二.GLE可能通過抑制caspase-3激活,上調bcl-

7、2/Bax的比值而減少缺氧復氧神經元凋亡;三.GLE可能通過下調caspase-8和caspase-9進而抑制caspase-3表達。
　　 第二部分:羅布麻提取物(Apocynumvenetumleafextract,AVLE)對神經元缺氧復氧損傷的保護作用及其機制研究
　　 目的研究GLE對原代大鼠皮層神經元OGD損傷模型的影響,在細胞水平探討GLE神經保護作用的科學機制。
　　 方法新生SD大鼠的皮層神經元

8、原代培養(yǎng)至第7天,AVLE預處理神經元OGD模型。選取OGD復氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作為觀察點,觀察GLE干預后對各個時間點的細胞形態(tài)學、細胞毒作用、細胞線粒體活性、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的表達量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影響。細胞形態(tài)學采用倒置相差顯微鏡觀察;細胞毒作用采用LDH釋放測定:細胞線粒體活性采用XTT檢測分析;細胞凋亡率采用流式細胞

9、技術檢測;蛋白質表達水平分析采用westernblot。
　　 結果一.光鏡形態(tài)學觀察:OGD復氧后3h開始,神經元出現(xiàn)損傷進行性加重,OGD復氧后72h時損傷最明顯,500μg/ml和5000μg/mlAVLE干預組在OGD復氧后24h至72h有減輕神經元損傷的作用。二.LDH的釋放量在OGD復氧后3h開始有所增高,隨復氧的時間延長進一步增高,至72h達到最高值。5000μg/mlAVLE組在OGD復氧后12h、24h、48h

10、和72h時均能明顯減少LDH的釋放,500μg/mlAVLE在OGD復氧后48h、72h能明顯減少LDH的釋放,有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。三.OGD復氧后3h開始細胞線粒體活性逐漸降低,隨復氧時間的延長進一步下降,至72h達到最低值,5000μg/mlAVLE組在OGD復氧后12h、24h、48h和72h時能增強細胞活力,而500μg/ml在OGD復氧后48h、72h才體現(xiàn)出增強細胞活力的作用。四.OGD復氧后24h時,模型組平

11、均凋亡率較正常組顯著增高(P＜0.001),5000μg/mlAVLE組平均凋亡率較模型組顯著降低(P＜0.001),但50μg/m1和500μg/mlAVLE與模型組相比無明顯差異;OGD復氧后72h時,500μg/mlAVLE組和5000μg/mlAVLE組的平均凋亡率均較模型組顯著降低(P＜0.05),50μg/mlAVLE與模型組相比無明顯差異。五.OGD復氧后24h時,westernblot結果顯示模型組caspase-3,c

12、aspase-8caspase-9蛋白表達增高;5000μg/mlAVLE能抑制caspase-3,caspase-8的表達,50μg/ml和500μg/mlAVLE抑制效果不明顯;各濃度的AVLE均未能抑制caspase-9的表達。另外,模型組Bcl-2蛋白明顯下降,Bax蛋白表達明顯增高,AVLE各濃度組的bcl-2蛋白表達均明顯下降;5000μg/mlAVLE能明顯抑制Bax蛋白的表達,但50μg/ml和500μg/mlAVLE對