胰島素樣生長因子-1對HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的相關(guān)保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：探討研究缺氧復(fù)氧損傷對人腎小管上皮細(xì)胞的損害和在胰島素樣生長因子-1(IGF-1)干預(yù)后對細(xì)胞凋亡基因相關(guān)蛋白Bcl-2和水通道蛋白AQP-1的影響及可能保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：常規(guī)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24h后隨機(jī)分為5組：①正常對照(C組)：細(xì)胞不予特殊處理，按常規(guī)方法培養(yǎng)。②缺氧復(fù)氧損傷模型組(H/R組):用終濃度300μmol/L的氯化鈷(CoCl2)處理60min后更換成含10[％]FBS的

2、DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24h；③預(yù)先給藥組(B組):預(yù)先給予終濃度200ng/ml的IGF-1，培養(yǎng)60min后去除上清液，換為終濃度300μmol/L的CoCl2培養(yǎng)孵育60min，再更換為10[％]FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h。④即時(shí)給藥組(S組):同時(shí)給予HK-2細(xì)胞終濃度300μmol/L的CoC12和終濃度200ng/ml的IGF-1，培養(yǎng)60min后更換為10[％]FBS的DMEM/F12培養(yǎng)

3、液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。⑤延遲給藥組(A組):先用終濃度300μmol/LCoCl2模擬缺氧，處理60 min后去上清液，加入終濃度200ng/ml的IGF-1培養(yǎng)1h，更換為正常10[％]FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處理完后：倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況、LDH試劑盒檢測各組細(xì)胞上清液LDH漏出量，細(xì)胞免疫組化方法檢測Bcl-2與AQP-1的

4、表達(dá)變化、Real-time 熒光定量PCR檢測Bcl-2 mRNA與AQP-1 mRNA表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：⑴成功構(gòu)建HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型；⑵ MTT法測細(xì)胞OD值：H/R組較C組明顯降低(P<0.05)，3個(gè)IGF-1 干預(yù)組較H/R組OD值有所升高，以B組上升最明顯(P<0.01)。⑶流式細(xì)胞儀測得細(xì)胞凋亡率：正常C組僅存在極低凋亡率(2.06±0.38[％])，H/R組細(xì)胞凋亡率較C組明顯升高(P<0.05)

5、，3個(gè)IGF-1 干預(yù)組較H/R組顯著下降(P<0.05)，其中又以B組下降最明顯(P<0.01)。⑷細(xì)胞上清液的LDH 漏出量;缺氧復(fù)氧損傷模型組(H/R組)LDH 活性較C組顯著增加(P<0.01)，IGF-1 干預(yù)處理組較H/R組漏出量減少，以B組降低最明顯(P<0.01)。⑸免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示：H/R組AQP-1mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)較C組降低(P<0.05)，細(xì)胞免疫組化顯示AQP-1 與Bcl-2蛋