神經(jīng)修復(fù)對(duì)產(chǎn)癱近端神經(jīng)元影響機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分幼年大鼠神經(jīng)根斷裂后移植修復(fù)對(duì)神經(jīng)元存活影響的研究 目的 研究幼年大鼠臂叢神經(jīng)根損傷后早期神經(jīng)移植手術(shù)對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元存活的影響，探討早期臂叢修復(fù)對(duì)產(chǎn)癱近端神經(jīng)元影響作用的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。 方法 取SPF級(jí)Sprague-Dawley幼年大鼠(生后18天，下同)24只，等分為2組：神經(jīng)根切斷組和神經(jīng)根修復(fù)組。采用TrueBlue注射法逆行標(biāo)記近端神經(jīng)元。神經(jīng)根切斷組將右側(cè)頸5

2、神經(jīng)根切除0．3cm；神經(jīng)根修復(fù)組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經(jīng)行移植修復(fù)(0．3cmx3股)。術(shù)后4周取頸5脊髓前角和背根神經(jīng)節(jié)，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)凋亡的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)元，比較兩組近端神經(jīng)元及凋亡細(xì)胞數(shù)量的差異。 結(jié)果 術(shù)后4周，神經(jīng)根修復(fù)組及切斷組脊髓前角TrueBlue標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分別為1495~645．1和656~160．6個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)中TrueBlue標(biāo)記的感覺(jué)神經(jīng)元分別為3415~1251．9和40

3、6~190．4個(gè)。神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)量明顯多于神經(jīng)根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元f值為3．09，P<0．05；感覺(jué)神經(jīng)元f值為5．82，P<0．01)。 TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示術(shù)后4周兩組大鼠近端神經(jīng)元均存在不同程度的凋亡。神經(jīng)根修復(fù)組及切斷組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞分別為85~3．9和136~44．2個(gè)，背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞分別為345~113．4和618~87．0個(gè)。神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神

4、經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯少于神經(jīng)根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元t值為2．79，P<0．05；感覺(jué)神經(jīng)元t值為4．68，P<0．01)。 結(jié)論 幼年大鼠神經(jīng)根損傷后即行修復(fù)手術(shù)可明顯減少近端運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元死亡，提示早期臂叢修復(fù)對(duì)產(chǎn)癱近端神經(jīng)元有保護(hù)作用。 第二部分幼年大鼠神經(jīng)根斷裂后移植修復(fù)對(duì)神經(jīng)元影響機(jī)制的研究 目的 觀察幼年大鼠神經(jīng)根損傷后即行神經(jīng)移植手術(shù)對(duì)神經(jīng)元退變程摩、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其

5、受體數(shù)量的影響，從細(xì)胞水平探索早期臂叢修復(fù)對(duì)產(chǎn)癱近端神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制。 方法 取SPF級(jí)Sprague-Dawley幼年大鼠36只，等分為2組：神經(jīng)根切斷組和神經(jīng)根修復(fù)組。神經(jīng)根切斷組將右側(cè)頸5神經(jīng)根切除0．3cm；神經(jīng)根修復(fù)組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經(jīng)行移植修復(fù)(0．3cmx3股)。術(shù)后4周取頸5脊髓前角和背根神經(jīng)節(jié)，行酶組織化學(xué)染色分析神經(jīng)元膽堿酯酶(CHE)和酸性磷酸酶(ACP)陽(yáng)性顆粒的平均灰度及面積百分率

6、，行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)元中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)及其受體GFRal免疫陽(yáng)性顆粒的數(shù)量，并比較兩組間的差異。 結(jié)果 術(shù)后4周，神經(jīng)根修復(fù)組及切斷組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CHE陽(yáng)性顆粒平均灰度分別為29．1±4．21和23．5±4．60，面積百分率分別為46,4±3．45％和41．5±3．03％；感覺(jué)神經(jīng)元CHE陽(yáng)性顆粒平均灰度分別為43．3±3．04和34．8±2．40，面積百分率分別為68．6±3．86％和53．

7、9±2．56％。神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元CHE陽(yáng)性顆粒平均灰度及面積百分率均高于神經(jīng)根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元兩指標(biāo)t值分別為2．23和2．60，P均<0．05；感覺(jué)神經(jīng)元兩指標(biāo)f值分別為5．40和5．53，P均<0．01)。 神經(jīng)根修復(fù)組及切斷組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ACP陽(yáng)性顆粒平均灰度分別為41．5±3．51和52．4±6．08，面積百分率分別為¨5．5±9．74％和135．9±7．88％；感覺(jué)神經(jīng)元ACP陽(yáng)性顆粒

8、平均灰度分別為55．0±2．19和60．9±2．74，面積百分率分別為162．1±19．65％和255．5±36．41％。神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元ACP陽(yáng)性顆粒平均灰度及面積百分率均低于神經(jīng)根切斷組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元兩指標(biāo)f值分別為3．79和3．98，P均<0．05；感覺(jué)神經(jīng)元兩指標(biāo)f值分別為4．15和5．53，P均<0．01)。 免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元GDNF免疫陽(yáng)性顆粒數(shù)目分別為

9、786．3~176．84和2997．0~357．99個(gè)，神經(jīng)根切斷組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元陽(yáng)性顆粒數(shù)目分別為335．0~49．50和1632．0~305．55個(gè)，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元t值分別為6．02和7．10，P均<0．01)。 神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元GFRal免疫陽(yáng)性顆粒數(shù)目分別787．5+178．55和3¨1．0~445．72個(gè)，神經(jīng)根切斷組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元陽(yáng)性顆粒數(shù)目分別為397．3~41．78和1

10、588．3~229．00個(gè)，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元t值分別為5．21和7．44，P均<0．01)。 結(jié)論 幼年大鼠早期神經(jīng)根修復(fù)對(duì)近端神經(jīng)元的保護(hù)作用與神經(jīng)元退變程度減輕、代謝功能改善、GDNF及其受體GFRal數(shù)量增加有關(guān)。 第三部分幼年大鼠神經(jīng)根斷裂后移植修復(fù)對(duì)神經(jīng)元凋亡基因表達(dá)影響的研究 目的 觀察幼年大鼠神經(jīng)根損傷后即行神經(jīng)移植修復(fù)對(duì)近端神經(jīng)元C-Jun和Bcl-2表達(dá)

11、水平的影響，從分子水平探討早期臂叢修復(fù)手術(shù)對(duì)產(chǎn)癱近端神經(jīng)元保護(hù)作用的原因。 方法 取SPF級(jí)Sprague-Dawley幼年大鼠12只，等分為2組：神經(jīng)根切斷組、神經(jīng)根修復(fù)組。神經(jīng)根切斷組將右側(cè)頸5神經(jīng)根切除0．3cm；神經(jīng)根修復(fù)組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經(jīng)行移植修復(fù)(0．3cmx3股)。術(shù)后4周取頸5脊髓前角和背根神經(jīng)節(jié)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealTimeRT-PCR)檢測(cè)大鼠近端神經(jīng)元C-Ju

12、n、Bcl-2mRNA的表達(dá)水平，并比較兩組間的差異。 結(jié)果 術(shù)后4周，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)顯示神經(jīng)根修復(fù)組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元C-JunmRNA的表達(dá)量分別為7．8+2．32和4．5~1．05copies，神經(jīng)根切斷組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元C-JunmRNA的表達(dá)量分別為34．2~9．15和7．0~1．10copies，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元t值分別為6．83和4．04，P均<0．

13、01)。 神經(jīng)根修復(fù)組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元Bcl-2mRNA的表達(dá)量分別1252．3~66．31和725．5~100．27copies，神經(jīng)根切斷組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元Bcl-2mRNA的表達(dá)量分別843．3士162．46和433．3~98．93copies，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元t值分別為5．71和5．08，尸均<0．01)。 結(jié)論 幼年大鼠經(jīng)早期神經(jīng)根修復(fù)后其近端神經(jīng)元C-Jun表達(dá)量增加、Bcl

14、-2表達(dá)量減少，表明凋亡基因表達(dá)水平變化是早期臂叢修復(fù)手術(shù)保護(hù)近端神經(jīng)元的分子機(jī)制。 第四部分幼年大鼠神經(jīng)根斷裂后不同時(shí)間的移植修復(fù)對(duì)神經(jīng)元影響的研究 目的 研究幼年大鼠神經(jīng)根切斷后不同時(shí)間的神經(jīng)移植修復(fù)對(duì)近端感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活數(shù)量的影響，為臨床上確立產(chǎn)癱的最佳手術(shù)時(shí)機(jī)提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 取SPF級(jí)Sprague-Dawley幼年大鼠48只，隨機(jī)等分為8組。一組為單純切斷組，余7組分別為：

15、立即修復(fù)組和3、6、9、12、15、18天修復(fù)組。采用TrueBlue注射法逆行標(biāo)記神經(jīng)元。單純切斷組將右側(cè)頸5神經(jīng)根切除0．3cm；立即修復(fù)組將頸5切除一段后即取自體腓腸神經(jīng)行移植修復(fù)(0．3cmx3股)。其余各組分別在頸5切斷后間隔相應(yīng)時(shí)間修復(fù)神經(jīng)根。術(shù)后4周取頸5脊髓前角和背根神經(jīng)節(jié)，比較各組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元存活的數(shù)量。 結(jié)果 幼年大鼠頸5切斷后，3、6天修復(fù)組與立即修復(fù)組近端神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均

16、>0．05)，上述三組神經(jīng)元數(shù)量較單純切斷組顯著增多(P均<0．05)。與立即修復(fù)組相比，9天修復(fù)組近端感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0．05)，但運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0．05)。單純切斷組和15、18天修復(fù)組近端神經(jīng)元數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0．05)。 結(jié)論 幼年大鼠神經(jīng)根損傷后，在O～9天(相當(dāng)于人類0～6個(gè)月)內(nèi)修復(fù)對(duì)近端神經(jīng)元可產(chǎn)生較滿意的保護(hù)作用，且呈越早手術(shù)療效越顯著的趨勢(shì)。這提示臨床上對(duì)有手