GDNF對(duì)培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P物質(zhì)釋放的影響及作用機(jī)制.pdf

1、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族的成員，被認(rèn)為是一種在體內(nèi)有廣泛表達(dá)并且作用復(fù)雜的多效能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，目前已知在離體培養(yǎng)的情況下，GDNF對(duì)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)許多部分神經(jīng)元具有明顯的營(yíng)養(yǎng)活性。 GDNF對(duì)受刺激或損傷的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的可塑性具有影響，GDNF能

2、夠介導(dǎo)DRG神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)事件，如神經(jīng)元突起內(nèi)線粒體的運(yùn)輸或聚集以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化等。但GDNF對(duì)正常DRG神經(jīng)元有沒(méi)有特異性作用尚不清楚。 辣椒素可以激活感覺(jué)神經(jīng)元而引起痛覺(jué)，并呈劑量相關(guān)性地釋放P物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)等神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)和興奮性氨基酸。辣椒素受體(vanilloid receptor,VR1)，廣泛

3、分布于DRG神經(jīng)元上，可被多種傷害刺激激活，是傷害性感受器的興奮因子。 SP是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。SP在DRG小型神經(jīng)元胞體合成后，經(jīng)快速軸漿運(yùn)輸至中樞端及外周端，而神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的多少反映了神經(jīng)元的功能狀態(tài)，神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)與神經(jīng)元的功能狀態(tài)有關(guān)，其釋放量的多少反映了神經(jīng)元的功能狀態(tài)。小劑量應(yīng)用辣椒素可興奮感覺(jué)神經(jīng)末梢，并引起感覺(jué)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但是GDNF對(duì)培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元功能狀態(tài)，如神經(jīng)遞質(zhì)SP的

4、釋放的影響作用目前尚不清楚。 基于以上研究背景，本研究將原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元施加不同濃度GDNF，探測(cè)GDNF對(duì)培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元中SP釋放的影響作用。將胎齡為15d的Wistar胎鼠DRG神經(jīng)元分散培養(yǎng)，觀察有GDNF(5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml)和沒(méi)有GDNF孵育的神經(jīng)元的活細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，用微管相關(guān)蛋白2(mierotubule associated protein 2，MAP2)和4',6二

5、脒基-2-苯吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)雙染DRG神經(jīng)元，計(jì)數(shù)神經(jīng)元數(shù)目，并用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)辣椒素孵育前、后SP的釋放，用Western blot分析SP和VR1的表達(dá)。根據(jù)以上各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果綜合分析GDNF對(duì)DRG神經(jīng)元SP釋放的影響作用及其機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： (1)各組DRG神經(jīng)元倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果：正常培養(yǎng)的D

6、RG神經(jīng)元呈單層散在分布，由單個(gè)神經(jīng)元發(fā)出的突起相互交織成網(wǎng)狀；用GDNF孵育的神經(jīng)元用GDNF孵育的神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況良好。 (2)MAP2和DAPI熒光雙染：可見(jiàn)MAP2標(biāo)記的神經(jīng)元和DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，隨著GDNF孵育濃度的增加神經(jīng)元胞體更加密集。 (3)神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果：用GDNF孵育的標(biāo)本，單位視野內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)目明顯增加，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。 (4)SP釋放量檢測(cè)結(jié)果：用GDNF孵育

7、的標(biāo)本，SP的基礎(chǔ)釋放量和由辣椒素刺激后誘發(fā)的SP釋放量均較對(duì)照組顯著性增加，而且由辣椒素刺激后誘發(fā)的SP釋放量增加的幅度明顯高于SP基礎(chǔ)釋放量增加的幅度。由辣椒素刺激后誘發(fā)的SP釋放量與GDNF呈劑量依賴關(guān)系。 (5)Western blot分析SP表達(dá)的結(jié)果：與對(duì)照組相比，GDNF孵育的標(biāo)本，SP表達(dá)量增加。 (6)Western blot分析VR1表達(dá)的結(jié)果：與對(duì)照組相比，GDNF孵育的標(biāo)本，VR1表達(dá)量增加。