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1、疼痛是傷害性或潛在組織損傷引起的不愉快感覺(jué),常伴有內(nèi)分泌、代謝、免疫和精神心理改變。課題組采用有機(jī)溶劑萃取、大孔樹(shù)脂層析等方法從野生雞矢藤中分離提取到其活性成份雞矢藤環(huán)烯醚萜總苷(Iridoidglycosidesofpaederiascandens,IGPS),主要包括車(chē)葉草苷(asperuloside)、雞矢藤苷(paederoside)及雞矢藤次苷(scandoside)等。中醫(yī)理論認(rèn)為雞矢藤味酸、苦入肝胃而有滲利水濕、祛風(fēng)活血、
2、舒筋活絡(luò)、止痛解毒等功效。前期研究結(jié)果顯示,IGPS對(duì)多種疼痛模型均具有良好的鎮(zhèn)痛作用,本實(shí)驗(yàn)旨在研究IGPS含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經(jīng)元的影響,尋求IGPS含藥血清鎮(zhèn)痛作用的有效靶點(diǎn),為其臨床提供充足的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)
無(wú)菌條件下,取新生大鼠背根神經(jīng)節(jié),加入膠原酶-中性蛋白酶消化液,37℃CO2培養(yǎng)箱消化,加入5
3、-氟-2’脫氧尿苷(5-FUDR)以純化神經(jīng)元,MEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)免疫組織化學(xué)染色鑒定DRG神經(jīng)元的純度。
細(xì)胞生存狀態(tài)良好,可以純活兩周以上。低濃度的5-FUDR(10mmol/L)可以很好的純化DRG神經(jīng)元,細(xì)胞純度高于90%以上。
2.新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷模型的制備
DRG神經(jīng)元培養(yǎng)至第五天,狀態(tài)完全穩(wěn)定后加
4、入不同濃度(20、200、2000μmol/L)的NO供體硝普鈉(sodiumnitroprusside,SNP)作用于DRG神經(jīng)元15min,制備DRG神經(jīng)元損傷模型。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色顯示,在200μmol/L濃度SNP作用下,DRG神經(jīng)元的存活率為50%,DRG損傷程度最為適宜。
3.IGPS含藥血清的制備
SD大鼠隨機(jī)分組,IGPS(70、140、280mg/kg)灌胃(ig)給藥,每日2次,連續(xù)3d。末次灌胃1h
5、后固定大鼠,腹主動(dòng)脈采血,4℃下靜置過(guò)夜,微孔濾膜濾過(guò)除菌分離血清,-20℃條件下保存?zhèn)溆谩8鹘M含藥血清用細(xì)胞培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋。
4.IGPS含藥血清對(duì)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元SNP損傷模型的影響
研究IGPS含藥血清對(duì)新生大鼠DRG神經(jīng)元影響及其可能機(jī)制。臺(tái)盼藍(lán)染色法及MTT法測(cè)定IGPS含藥血清對(duì)SNP損傷后DRG神經(jīng)元的存活率的影響;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)新生大鼠DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的變化;紫外分光
6、光度法測(cè)定新生大鼠DRG神經(jīng)元NO含量和iNOS活性;放射免疫分析法測(cè)定新生大鼠DRG神經(jīng)元cGMP的含量;RT-PCR法檢測(cè)新生大鼠DRG神經(jīng)元iNOSmRNA、PKGΙαmRNA和PKGIβmRNA的表達(dá)。
結(jié)果顯示,IGPS含藥血清(140、280mg/kg,ig)可以明顯抑制SNP損傷后DRG神經(jīng)元的死亡;IGPS含藥血清(280mg/kg,ig)組可有效抑制損傷DRG胞內(nèi)鈣離子濃度的升高;IGPS含藥血清(140、2
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