電刺激促進大鼠背根神經節(jié)神經元突起生長及機制研究.pdf

1、周圍神經損傷后，軸突變性、炎癥反應等逐漸引起神經元變性、壞死；損傷處的雪旺細胞和成纖維細胞等互相作用，形成結締組織瘢痕，對軸突再生并到達遠端靶器官造成阻礙。有效促進周圍神經再生，使其在不良因素形成前到達靶器官，是研究和治療周圍神經損傷的新思路之一。
　　大量體內實驗表明電刺激能夠有效促進周圍神經再生，然而電刺激促進損傷神經修復涉及到細胞內眾多分子通路，內在機制十分復雜。我們前期已對電刺激促進體外培養(yǎng)的雪旺細胞分泌神經營養(yǎng)因子的具體

2、機理進行了探討，但目前對電刺激干預體外培養(yǎng)的神經元及其內在機制還缺乏深入系統(tǒng)的研究。
　　為此，我們采用體外原代培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元，全面篩選有效促進神經元突起生長的電刺激參數，利用此參數電刺激對神經元進行干預，并驗證可能參與這些過程的信號通路。本研究為我們深入理解周圍神經再生的分子機理提供新的實驗依據和理論基礎。
　　目的：篩選能夠激活體外原代培養(yǎng)神經元突起再生的電信號參數，從基因、分子、細胞等多層次探討電信號促進神經元

3、突起再生的信號通路。
　　方法：（1）使用無血清Neurobasal/B27培養(yǎng)基、低密度體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)背根神經節(jié)神經元；（2）從雙/單相、刺激時間、刺激電壓、刺激頻率這四個方面對神經元進行電刺激干預，免疫細胞化學染色后，利用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測量突起長度，篩選有效促進突起生長的電參數；（3）利用激光共聚焦/鈣成像技術結合藥理學實驗觀察電刺激作用下神經元胞內鈣離子水平的變化，并研究鈣離子變化的來源；（4

4、）通過阻斷鈣離子來源并從分子或mRNA水平，觀察電刺激過程中神經元突起再生及神經元表達c-fos、腦源性神經營養(yǎng)因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）與鈣離子的相關性；（5）抑制鈣-鈣調蛋白依賴的蛋白激酶（calcium-CaM-dependentproteinkinases，CaMKs）后，觀察電刺激作用下神經元中磷酸化的環(huán)磷酸腺苷-反應元件結合蛋白（phosphorylatedcAMP-res

5、ponsiveelementbindingprotein，pCREB）、c-fos、BDNF表達及突起再生情況。
　　結果：（1）神經元生長狀態(tài)良好，純度達到(92±6)％；（2）在電刺激給予后的1、3、5d這三個時間點觀察到，雙相電、刺激30min、電壓5V、頻率10Hz這樣的電刺激參數組合，能夠有效促進神經突起生長；（3）電刺激作用下，神經元胞內鈣離子水平上升，胞內增加的鈣離子來源于兩個途徑：①L、N型電壓依賴性鈣通道（vol

6、tage-dependentcalciumchannel，L-VDCC、N-VDCC）參與鈣離子從胞外向胞內的轉運；②三磷酸肌醇受體（IP3receptor，IP3R）鈣庫和斯里蘭卡肉桂堿受體（ryanodinereceptor，RyR）鈣庫參與胞內鈣動員過程；（4）電刺激誘導神經元突起再生加快及增強神經元表達c-fos、BDNF呈現明顯的鈣依賴性；（5）CaMKs參與電刺激增強神經元中pCREB、c-fos、BDNF的表達；（6）Ca