電刺激促進(jìn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)及機(jī)制研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后，軸突變性、炎癥反應(yīng)等逐漸引起神經(jīng)元變性、壞死；損傷處的雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等互相作用，形成結(jié)締組織瘢痕，對(duì)軸突再生并到達(dá)遠(yuǎn)端靶器官造成阻礙。有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，使其在不良因素形成前到達(dá)靶器官，是研究和治療周圍神經(jīng)損傷的新思路之一。
　　大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明電刺激能夠有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，然而電刺激促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)涉及到細(xì)胞內(nèi)眾多分子通路，內(nèi)在機(jī)制十分復(fù)雜。我們前期已對(duì)電刺激促進(jìn)體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的具體

2、機(jī)理進(jìn)行了探討，但目前對(duì)電刺激干預(yù)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元及其內(nèi)在機(jī)制還缺乏深入系統(tǒng)的研究。
　　為此，我們采用體外原代培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，全面篩選有效促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的電刺激參數(shù)，利用此參數(shù)電刺激對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)，并驗(yàn)證可能參與這些過程的信號(hào)通路。本研究為我們深入理解周圍神經(jīng)再生的分子機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　目的：篩選能夠激活體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起再生的電信號(hào)參數(shù)，從基因、分子、細(xì)胞等多層次探討電信號(hào)促進(jìn)神經(jīng)元

3、突起再生的信號(hào)通路。
　　方法：（1）使用無血清Neurobasal/B27培養(yǎng)基、低密度體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元；（2）從雙/單相、刺激時(shí)間、刺激電壓、刺激頻率這四個(gè)方面對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行電刺激干預(yù)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，利用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測(cè)量突起長(zhǎng)度，篩選有效促進(jìn)突起生長(zhǎng)的電參數(shù)；（3）利用激光共聚焦/鈣成像技術(shù)結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察電刺激作用下神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平的變化，并研究鈣離子變化的來源；（4

4、）通過阻斷鈣離子來源并從分子或mRNA水平，觀察電刺激過程中神經(jīng)元突起再生及神經(jīng)元表達(dá)c-fos、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）與鈣離子的相關(guān)性；（5）抑制鈣-鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶（calcium-CaM-dependentproteinkinases，CaMKs）后，觀察電刺激作用下神經(jīng)元中磷酸化的環(huán)磷酸腺苷-反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylatedcAMP-res

5、ponsiveelementbindingprotein，pCREB）、c-fos、BDNF表達(dá)及突起再生情況。
　　結(jié)果：（1）神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好，純度達(dá)到(92±6)％；（2）在電刺激給予后的1、3、5d這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到，雙相電、刺激30min、電壓5V、頻率10Hz這樣的電刺激參數(shù)組合，能夠有效促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)；（3）電刺激作用下，神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平上升，胞內(nèi)增加的鈣離子來源于兩個(gè)途徑：①L、N型電壓依賴性鈣通道（vol

6、tage-dependentcalciumchannel，L-VDCC、N-VDCC）參與鈣離子從胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)；②三磷酸肌醇受體（IP3receptor，IP3R）鈣庫和斯里蘭卡肉桂堿受體（ryanodinereceptor，RyR）鈣庫參與胞內(nèi)鈣動(dòng)員過程；（4）電刺激誘導(dǎo)神經(jīng)元突起再生加快及增強(qiáng)神經(jīng)元表達(dá)c-fos、BDNF呈現(xiàn)明顯的鈣依賴性；（5）CaMKs參與電刺激增強(qiáng)神經(jīng)元中pCREB、c-fos、BDNF的表達(dá)；（6）Ca