初級(jí)傳入神經(jīng)元激活對(duì)周圍神經(jīng)元和非神經(jīng)元的信號(hào)調(diào)制.pdf

1、第一部分
　　 雖然神經(jīng)元之間最主要的通訊方式是化學(xué)突觸，但是電突觸和非突觸性化學(xué)傳遞也占據(jù)著重要地位。可在背根神經(jīng)節(jié)(dosal root ganglion，DRG)內(nèi)的初級(jí)神經(jīng)元之間因?yàn)樾l(wèi)星細(xì)胞的分隔，即缺少化學(xué)突觸也無(wú)電突觸，而大量的研究發(fā)現(xiàn)卻表明節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞間能相互影響，即刺激誘導(dǎo)一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞興奮，另一個(gè)鄰近的細(xì)胞也被動(dòng)發(fā)生興奮性改變，這種現(xiàn)象被命名為“交叉興奮”(cross excitation)，而產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)

2、制還只是在猜測(cè)之中。以視神經(jīng)節(jié)為材料的研究又發(fā)現(xiàn)，節(jié)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞興奮釋放的活性物質(zhì)通過(guò)它相應(yīng)的受體能誘導(dǎo)細(xì)胞間通訊，然而對(duì)這種胞間通訊模式機(jī)制的確定，以及在其他節(jié)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞間尋找更多的支持顯得非常必要。在本研究中，我們?cè)谂囵B(yǎng)的DRG神經(jīng)元間發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由ATP介導(dǎo)的非突觸性化學(xué)傳遞模式。單個(gè)DRG神經(jīng)元持續(xù)去極化激起這個(gè)細(xì)胞的胞內(nèi)鈣振蕩性升高，持續(xù)性的鈉離子內(nèi)流，以及接下來(lái)細(xì)胞體的ATP釋放并向周圍擴(kuò)散最終誘發(fā)鄰近未受刺激的被動(dòng)細(xì)胞內(nèi)規(guī)則的

3、鈣振蕩。
　　 鈣振蕩和鈉離子內(nèi)流均能被TTX抑制，但不受細(xì)胞外鈣離子濃度的影響，且在無(wú)鈣溶液中仍能發(fā)生，表明鈉離子內(nèi)流介導(dǎo)的細(xì)胞膜去極化以及胞內(nèi)鈣釋放是鈣振蕩產(chǎn)生的原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鈣振蕩產(chǎn)生的源在IP3受體引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的鈣釋放，而不由ryanodine受體介導(dǎo)。采用ATP實(shí)時(shí)成像跟蹤了ATP的釋放和擴(kuò)散，且ATP水解酶徹底瓦解鈣振蕩擴(kuò)散，說(shuō)明神經(jīng)激活釋放了化學(xué)物質(zhì)ATP，它們?cè)贒RG神經(jīng)元間擔(dān)當(dāng)著傳遞信使。我們又發(fā)現(xiàn)

4、非選擇性P2Y受體抑制劑蘇拉明、PLC 抑制劑U73122、以及IP3受體拮抗劑2-APB能抑制鈣振蕩傳播，這就表明了介導(dǎo)ATP傳播作用的受體途徑。為了更充分地描述ATP在這一現(xiàn)象中的作用，外源性ATP被應(yīng)用到DRG細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ATP通過(guò)P2Y受體在DRG神經(jīng)元不是引起一過(guò)性鈣升高，就是誘發(fā)鈣振蕩，10μM—100μM的ATP激起一過(guò)性鈣升高，100μM—250μM的ATP誘發(fā)鈣振蕩。因此，根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們總結(jié)持續(xù)去極化

5、刺激引起細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩性釋放和ATP釋放，胞內(nèi)鈣升高是ATP釋放的先決條件，接著釋放的ATP通過(guò)它的代謝性受體引發(fā)了下一個(gè)細(xì)胞的鈣振蕩，完成它的傳播作用。這是一種特殊的通訊形式，可能是DRG神經(jīng)元間電興奮性胞間傳遞的分子基礎(chǔ)。
　　 第二部分
　　 成纖維細(xì)胞是非興奮性細(xì)胞，它們高度表達(dá)縫隙連接蛋白并形成縫隙連接通訊進(jìn)行著離子、分子的交流，除了同種細(xì)胞間形成廣泛的三維結(jié)構(gòu)外，成纖維細(xì)胞還與其他類型的細(xì)胞形成縫隙連接，比如內(nèi)

6、皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。縫隙連接通訊在成纖維細(xì)胞參與的生理和病理過(guò)程中起著重要作用，例如參與發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥等過(guò)程。在此研究中我們發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元和真皮成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，神經(jīng)元活動(dòng)能抑制成纖維細(xì)胞的縫隙連接通訊，它的抑制作用與NMDA 谷氨酸受體興奮以及由它們介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高有關(guān)。在共培養(yǎng)的DRG 神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞樣品中，去極化電刺激誘導(dǎo)神經(jīng)元興奮后，檢測(cè)成纖維細(xì)胞的染料偶聯(lián)率，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞的染料偶聯(lián)細(xì)胞數(shù)目減

7、少；并且未受到刺激的共培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞染料偶聯(lián)率也比單純成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的染料偶聯(lián)率低，這種情況發(fā)生在共培養(yǎng)5-6天后；膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元自動(dòng)發(fā)放動(dòng)作電位和TTX 敏感的鈉電流；免疫化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞最主要的連接蛋白CX43 表達(dá)減少，可能與連接通訊效率降低有關(guān)。但是立即檢測(cè)給予去極化電刺激的樣品中成纖維細(xì)胞的主要連接蛋白CX43，發(fā)現(xiàn)盡管染料偶聯(lián)率減少，CX43 表達(dá)并不減少，考慮縫隙連接通訊效能降低可能

8、還有主要其他機(jī)制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體抑制劑MK-801 能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元在縫隙連接通訊上的作用，而且NMDA 受體主要介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣升高已經(jīng)被認(rèn)為能抑制縫隙連接通訊；接著我們發(fā)現(xiàn)NMDA 受體和CX43 共表達(dá)于成纖維細(xì)胞膜上，外源性谷氨酸應(yīng)用能強(qiáng)有力地升高成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，并且降低成纖維細(xì)胞縫隙連接通訊，這部分作用能被NMDA 受體抑制劑MK-801 逆轉(zhuǎn)。我們還發(fā)現(xiàn)將共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基用于單純成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，也導(dǎo)致他

9、們的縫隙連接通訊下降。根據(jù)這些觀察我們總結(jié)去極化刺激導(dǎo)致的神經(jīng)元激活或者神經(jīng)元自發(fā)活動(dòng)能釋放谷氨酸，通過(guò)興奮NMDA 受體，升高細(xì)胞內(nèi)鈣抑制成纖維細(xì)胞的縫隙連接通訊。因此我們認(rèn)為除了已經(jīng)被證明的成纖維細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)外，神經(jīng)元活動(dòng)也通過(guò)其釋放的遞質(zhì)對(duì)成纖維細(xì)胞的通訊功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　 第三部分
　　 最近幾年，小動(dòng)物的整體成像已經(jīng)逐漸發(fā)展為一個(gè)探測(cè)發(fā)生在活體動(dòng)物細(xì)胞和分子水平生命活動(dòng)的強(qiáng)有力的研究工具。

10、在這個(gè)研究中，我們用一套整體熒光成像系統(tǒng)，在體檢測(cè)裸鼠體內(nèi)可能有的電針效應(yīng)表達(dá)。根據(jù)比較動(dòng)物學(xué)研究中在小動(dòng)物身上確定的幾個(gè)穴位點(diǎn)，我們嘗試在這些穴位點(diǎn)注射低分子量能透過(guò)縫隙鏈接的熒光染料5,6-carboxyfluorescein和Lucifer yellow 以及不能透過(guò)縫隙連接的大分子量熒光染料rhodamine dextran，然后進(jìn)行一系列掃描跟蹤熒光染料的擴(kuò)散，測(cè)量它們擴(kuò)散的速度和范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針能顯著誘導(dǎo)低分子熒光染料循著