初級(jí)傳入神經(jīng)元TRPM8在大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛中的作用.pdf

1、第一部分:神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達(dá)變化的研究
　　 目的:觀察慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)瞬時(shí)感受器電位melastatin8(TRPM8)表達(dá)的變化。
　　 方法：健康成年雄性SD大鼠72只,體重250～280g,隨機(jī)分為坐骨神經(jīng)慢性束縛性損傷(CCI)組和假手術(shù)組(n=36),CCI或假手術(shù)前1d,術(shù)后0、4、7、10、14d每組各隨機(jī)取6只大鼠,測(cè)定冷痛閾值、機(jī)械痛閾值和熱痛閾值后立即處死大鼠

2、,取術(shù)側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)行免疫組織化學(xué)染色,觀察TRPM8在慢性神經(jīng)病理性疼痛下的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：CCI組于術(shù)后4d術(shù)側(cè)冷痛閾值、機(jī)械痛閾值和熱痛閾值開(kāi)始下降,至術(shù)后14d仍處于較低水平,冷痛閾值和熱痛閾值于術(shù)后10d降至最低,機(jī)械痛閾值術(shù)后14d降至最低(P<0.05或P<0.01)；CCI組術(shù)側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá)于術(shù)后4d開(kāi)始增加,術(shù)后10d達(dá)到高峰,至術(shù)后14d仍維持在高水平(P<0.05或P<0.0

3、1)。
　　 結(jié)論：背根神經(jīng)節(jié)TRPM8受體表達(dá)的上調(diào)參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持。
　　 第二部分:薄荷醇和TRPM8反義寡核苷酸對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺(jué)過(guò)敏和背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達(dá)的影響
　　 目的:觀察鞘內(nèi)注射薄荷醇或TRPM8反義寡核苷酸對(duì)CCI大鼠痛覺(jué)過(guò)敏和TRPM8表達(dá)水平的影響,探討TRPM8通道在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 方法：第1部分:鞘內(nèi)置管成功的SD大鼠32只,隨機(jī)

4、分為4組(n=8):假手術(shù)+生理鹽水組(A組)；假手術(shù)+薄荷醇組(B組)；CCI+生理鹽水組(C組)；CCI+薄荷醇組fD組)。鞘內(nèi)置管后5d制備CCI或假手術(shù)模型,CCI或假手術(shù)后14d鞘內(nèi)單次注射生理鹽水20μl或薄荷醇100μg/kg。置管后行CCI或假手術(shù)前、術(shù)后14d給藥前和給藥后分別測(cè)定大鼠患肢冷板抬足次數(shù)、50％縮足反射閾值和熱板縮足反射潛伏期。術(shù)后14d行為學(xué)測(cè)試后立即處死大鼠,取患側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié),用免疫組織化學(xué)和we

5、stern blot方法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TRPM8蛋白的表達(dá)水平。第2部分:鞘內(nèi)置管成功的SD大鼠32只,隨機(jī)分為4組(n=8):假手術(shù)+‘TRPM8錯(cuò)義寡核苷酸組(E組)；假手術(shù)+TRPM8反義寡核苷酸組(F組)；CCI+TRPM8錯(cuò)義寡核苷酸組(G組)；CCI+TRPM8反義寡核苷酸組(H組)。鞘內(nèi)置管后5d制備CCI或假手術(shù)模型,CCI或假手術(shù)后9～13d連續(xù)5d鞘內(nèi)注射TRPM8反義或錯(cuò)義寡核苷酸,每天2次,每次60μg/kg。

6、置管后行CCI或假手術(shù)前、術(shù)后8d以及術(shù)后14d分別測(cè)定大鼠患肢冷板抬足次數(shù)、50％縮足反射閾值和熱板縮足反射潛伏期。術(shù)后14d行為學(xué)測(cè)試后立即處死大鼠,取患側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié),用免疫組織化學(xué)和western blot方法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TRPM8蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：第1部分:薄荷醇明顯減弱CCI大鼠的機(jī)械和熱痛覺(jué)過(guò)敏癥狀,顯著加強(qiáng)CCI大鼠的冷痛覺(jué)過(guò)敏程度。薄荷醇對(duì)假手術(shù)大鼠的機(jī)械、熱、冷痛覺(jué)過(guò)敏沒(méi)有明顯影響。兩CCI

7、組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá)水平明顯高于兩假手術(shù)組大鼠,薄荷醇單次鞘內(nèi)注射對(duì)CCI和假手術(shù)大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá)水平皆無(wú)明顯影響。第2部分:TRPM8反義寡核苷酸減弱了CCI大鼠的冷痛覺(jué)過(guò)敏,但對(duì)CCI大鼠的機(jī)械和熱痛覺(jué)過(guò)敏沒(méi)有明顯影響。TRPM8反義寡核苷酸對(duì)假手術(shù)大鼠的冷、熱和機(jī)械痛敏均沒(méi)有明顯影響。TRPM8反義寡核苷酸明顯減少CCI和假手術(shù)大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá),且使兩者降至同一水平。TRPM8錯(cuò)

8、義寡核苷酸對(duì)CCI和假手術(shù)大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：第1部分:薄荷醇通過(guò)激活TRPM8信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械和熱痛敏產(chǎn)生抑制作用,對(duì)其冷痛敏產(chǎn)生增強(qiáng)作用。TRPM8信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對(duì)假手術(shù)大鼠的冷痛敏、機(jī)械痛敏和熱痛敏均沒(méi)有明顯影響。第2部分:TRPM8反義寡核苷酸通過(guò)下調(diào)背根神經(jīng)節(jié)TRPM8蛋白的表達(dá),對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的冷痛覺(jué)過(guò)敏產(chǎn)生抑制作用。
　　 第三部分

9、:薄荷醇和TRPM8反義寡核苷酸與神經(jīng)病理性疼痛反應(yīng)的量效關(guān)系
　　 目的:建立薄荷醇和TRPM8反義寡核苷酸的劑量反應(yīng)曲線,確定薄荷醇激活TRPM8和TRPM8反義寡核苷酸抑制TRPM8的半數(shù)有效劑量(ED50)和95％有效劑量(ED95)。
　　 方法：第1部分:鞘內(nèi)置管成功的SD大鼠70只,隨機(jī)分為7組:生理鹽水組以及6個(gè)薄荷醇不同劑量組,每組10只。鞘內(nèi)置管后5d制備CCI模型,CCI模型建立后14d生理鹽水組鞘

10、內(nèi)單次注射生理鹽水20μl,6個(gè)薄荷醇組分別單次注射薄荷醇100.00、79.43、63.10、50.12、39.81和31.62μg/kg。采用概率單位回歸分析建立不同劑量薄荷醇的量效關(guān)系直線方程,計(jì)算薄荷醇的ED50和ED95。第2部分:鞘內(nèi)置管成功的SD大鼠70只,隨機(jī)分為7組:生理鹽水組以及6個(gè)TRPM8反義寡核苷酸不同劑量組,每組10只。鞘內(nèi)置管后5d制備CCI模型,CCI模型建立后9～13d生理鹽水組連續(xù)5d鞘內(nèi)注射生理鹽水

11、,每天2次,每次20μl,6個(gè)TRPM8反義寡核苷酸組連續(xù)5d注射TRPM8反義寡核苷酸,每天2次,每次的注射劑量分別為60.00、47.66、37.86、30.07、23.89和18.97μg/kg。采用概率單位回歸分析建立不同劑量TRPM8反義寡核苷酸的量效關(guān)系直線方程,計(jì)算TRPM8反義寡核苷酸的ED50和ED95。
　　 結(jié)果：薄荷醇的ED50和ED95分別為56.24μg/kg(95％置信區(qū)間為49.66～63.68μ

12、g/kg)和86.09μg/kg(95％置信區(qū)間為73.43～121.18μg/kg)。TRPM8反義寡核苷酸的ED50和ED95分別為31.37μg/kg(95％置信區(qū)間為27.85～35.37μg/kg)和46.34μg/kg(95％置信區(qū)間為39.87～64.65μg/kg)。
　　 結(jié)論：概率單位回歸分析所算得的薄荷醇激活TRPM8的ED50和ED95分別為56.24μg/kg和86.09μg/kg,TRPM8反義寡核苷