脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Pannexin1在神經(jīng)病理性疼痛大鼠中的作用.pdf

1、研究背景與目的:
　　神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain，NP)是常見但卻缺乏有效治療手段的臨床綜合征。國(guó)際疼痛協(xié)會(huì)在最新召開的年會(huì)上對(duì)其最新的定義是“創(chuàng)傷或疾病累及軀體感覺系統(tǒng)后直接導(dǎo)致的疼痛”[1]。臨床上以自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過(guò)敏、疼痛異常以及痛覺超敏為其典型特點(diǎn)[2]。NP是多由外周神經(jīng)損傷引起，也可因中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變導(dǎo)致，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，分子機(jī)制尚不完全清楚，近年來(lái)一直是疼痛領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。由于疼痛的緩解

2、機(jī)制還不清楚，雖然臨床上有大量的藥物正在治療NP，但是效果都不是特別理想。近年來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中起著重要的作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞正在被重新認(rèn)識(shí)，探索其激活的分子機(jī)制有可能為臨床疼痛治療提供新的思路。
　　Pannexin通道蛋白是一類縫隙連接蛋白(gap junctions，GJs)，目前發(fā)現(xiàn)存在三種亞型，廣泛存在于全身大部分組織中，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)[3]。它能連接兩個(gè)相鄰細(xì)胞，也能形成半通道與細(xì)

3、胞外液相通，能夠?qū)崿F(xiàn)離子及代謝小分子物質(zhì)在細(xì)胞和組織液間的快速交換。有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞上Pannexin1(PX1)半通道能夠通過(guò)控制ATP的釋放和調(diào)節(jié)鈣離子的內(nèi)流，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)[4]。本研究旨在通過(guò)建立坐骨神經(jīng)分支選擇性結(jié)扎模型（spared nerve injury, SNI），觀察大鼠脊髓背角PX1的表達(dá)變化以及通過(guò)鞘內(nèi)注射縫隙連接阻斷劑甘珀酸，分析PX1半通道與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系。
　　主要技術(shù)路線和方

4、法:
　　1.雄性SD大鼠24只隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組，n=4)、對(duì)照組（WT組，n=4）和坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷組(SNI組，n=16)。在術(shù)前、術(shù)后3、5、7、14天各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定大鼠右側(cè)后爪的50％機(jī)械痛縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。WT組和sham組大鼠均在術(shù)后7天處死，SNI組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)各取4只老鼠處死，均取脊髓L3～L6段用Western blot法檢測(cè)PX

5、1蛋白的表達(dá)水平。
　　2.雄性SD大鼠32只隨機(jī)分為sham組16只和SNI組16只，所有大鼠均在術(shù)前、術(shù)后3、5、7、14天各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定大鼠右側(cè)后肢的50％MWT。行為學(xué)測(cè)試后，sham組和SNI組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)各取4只處死，取脊髓L3～L6段進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)脊髓背角內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP)的表達(dá)水平。
　　3.雄性SD大鼠20只隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組，所有大鼠均于建模前先進(jìn)行鞘內(nèi)置管。A組:空白大

6、鼠+注射生理鹽水20uL;B組:sham大鼠+注射生理鹽水20uL;C組:SNI大鼠+注射生理鹽水20uL;D組:SNI大鼠+注射甘珀酸(CBX)20uL，所有大鼠均連續(xù)注射7天，每天一次。在注射前、注射后3、5、7天測(cè)定大鼠右側(cè)后爪的MWT值，并在注射7天后取脊髓L3～L6段進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)脊髓背角內(nèi)GFAP的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.WT組及sham組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MWT值比較無(wú)明顯變化。SNI組大鼠MWT值在

7、術(shù)后3天開始降低，在第7天達(dá)到最低值，第14天有所恢復(fù)，但仍低于術(shù)前(P＜0.05); SNI組各時(shí)間點(diǎn)MWT值較WT組和sham組均有明顯差異(P＜0.05)。而SNI組大鼠脊髓背角內(nèi)PX1表達(dá)增多，并隨時(shí)間增強(qiáng)，明顯高于對(duì)照組和sham組(P＜0.05); SNI組脊髓背角內(nèi)GFAP表達(dá)較WT組、sham組明顯增強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)均有差異(P＜0.05)。WT組及sham組脊髓背角的PX1和GFAP表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

8、
　　2.A、B兩組各時(shí)間點(diǎn)MWT值比較無(wú)明顯變化。C組D組注射后各時(shí)間點(diǎn)MWT值均明顯低于A、B組(P＜0.05)。D組注射后3天的MWT值與C組比較無(wú)差異，但是5天、7天所測(cè)的值要高于C組。免疫組化顯示，C、D兩組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平較A、B組高，但是D組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較C組均有明顯下調(diào)，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，其在SNI組中表達(dá)上調(diào)以及大鼠右