神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互調(diào)控在神經(jīng)病理性痛及鎮(zhèn)痛中的作用.pdf

1、【背景】
　　外傷、神經(jīng)壓迫、感染以及神經(jīng)退行性病變常常導(dǎo)致神經(jīng)病理性痛。然而由于對神經(jīng)病理性痛的誘導(dǎo)和維持的機(jī)制沒有全面的認(rèn)識，目前尚缺乏有效的鎮(zhèn)痛手段。長期以來，神經(jīng)病理性痛的研究一直圍繞著“神經(jīng)元為中心”的學(xué)術(shù)體系而開展的。近十年來，膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的作用引起越來越多的關(guān)注。我們的前期研究明確了脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性痛不同時(shí)程的狀態(tài)改變以及與疼痛的相關(guān)性，然而還有很多問題亟待解決。本研究在大鼠神經(jīng)病理性痛模型動(dòng)物上，

2、綜合利用神經(jīng)行為學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法，研究了神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用對脊髓背角局部環(huán)路可塑性的調(diào)控及其在神經(jīng)病理性痛中的作用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察干預(yù)神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的相互調(diào)控對疼痛的影響。結(jié)合上述基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究兩方面的相互印證，在進(jìn)一步闡明神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制的同時(shí)，為其治療提供新的策略。
　　【目的】
　　探討神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互調(diào)控在神經(jīng)病理性痛發(fā)展中的作用及相關(guān)的鎮(zhèn)痛策略。<

3、br>　　【方法】
　?。?）建立大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）神經(jīng)病理性痛模型；（2）運(yùn)用vonFrey纖維絲檢測大鼠SNL后機(jī)械性縮足閾值的改變；（3）運(yùn)用Hargreaves熱輻射法檢測SNL后熱縮足潛伏期的改變；（4）免疫熒光組織化學(xué)方法檢測脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（GLT-1）的表達(dá)變化；（5）運(yùn)用免疫熒光雙重標(biāo)記方法觀察GLT-1和GFAP的雙標(biāo)情況；（6）大鼠鞘內(nèi)置管給予c-fos反義寡核苷酸探針（AS

4、O）或星形膠質(zhì)細(xì)胞毒素L-AA；（7）運(yùn)用vonFrey纖維絲檢測給予c-fosASO或L-AA后大鼠機(jī)械性縮足閾值的改變；（8）免疫熒光組織化學(xué)方法檢測脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和Fos的表達(dá)變化；（9）運(yùn)用免疫熒光雙重標(biāo)記方法觀察Fos和GFAP、NeuN的雙標(biāo)情況；（10）Westernblot檢測SNL后JNK磷酸化的改變；（11）免疫熒光雙重標(biāo)記方法觀察pJNK和GFAP的雙標(biāo)情況；（12）大鼠鞘內(nèi)置管給予NMDA、pJNK

5、抑制劑SP600125、NMDA受體非選擇性拮抗劑MK-801、NR2B亞單位選擇性拮抗劑Ro25-6981和ifenprodi、nNOS選擇性抑制劑7-NINA以及鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ；（13）運(yùn)用vonFrey纖維絲檢測給予各種藥物后大鼠機(jī)械性縮足閾值的改變；（14）Westernblot檢測給予各種藥物后大鼠脊髓背角JNK磷酸化的改變；（15）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測給予各種藥物后大鼠脊髓背角JNK相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子包括I

6、L-1beta、TNF-alpha、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)以及IL-6等mRNA表達(dá)；（16）大鼠鞘內(nèi)置管給予不同劑量氯胺酮、星形膠質(zhì)細(xì)胞毒素L-AA以及兩種藥物聯(lián)用；（17）運(yùn)用vonFrey纖維絲檢測各種給藥對大鼠機(jī)械性縮足閾值的影響；（18）Westernblot檢測給予各種藥物后大鼠脊髓背角NMDA受體NR1亞單位磷酸化的改變；（19）免疫熒光組織化學(xué)方法檢測給予各種藥物后脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)變化；（2

7、0）運(yùn)用vonFrey纖維絲檢測預(yù)防性和治療性腹腔注射雷公藤提取物T4對SNL大鼠機(jī)械性縮足閾值的影響；（21）運(yùn)用Hargreaves熱輻射法檢測預(yù)防性和治療性腹腔注射雷公藤提取物T4后SNL大鼠熱縮足潛伏期的改變；（22）免疫熒光組織化學(xué)方法檢測給予T4對SNL大鼠脊髓背角GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42以及神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)變化；（23）Westernblot檢測T4對SNL大鼠脊髓背角絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）磷

8、酸化的影響；（24）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測T4對SNL大鼠脊髓背角痛相關(guān)的主要細(xì)胞因子、趨化因子mRNA表達(dá)的影響。
　　【結(jié)果】
　?。?）SNL后，同側(cè)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)顯著升高，熒光密度顯著高于損傷對側(cè)；（2）GLT-1的表達(dá)也明顯高于對側(cè)；免疫熒光雙重標(biāo)記顯示，GLT-1幾乎完全表達(dá)在GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞；（3）GFAP的表達(dá)在術(shù)后1d時(shí)幾乎沒有顯著的變化，3d開始明顯升高，在7d時(shí)達(dá)到高峰，直至

9、21d時(shí)仍維持在較高水平；（4）損傷同側(cè)脊髓背角GLT-1的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的雙相改變：術(shù)后1d時(shí)顯著高于對照組，3-5d時(shí)達(dá)到高峰，術(shù)后7d時(shí)恢復(fù)到正常水平，而在14d和21d時(shí)則顯著低于正常水平；（5）SNL誘導(dǎo)Fos蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP在脊髓背角的表達(dá)；（6）鞘內(nèi)給予c-fosASO或L-AA均能防止SNL誘導(dǎo)的疼痛行為反應(yīng)；（7）c-fosASO能夠抑制SNL后脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)；（8）LAA縮短SN

10、L后脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)時(shí)程；（9）SNL后7dpJNK以及GFAP在神經(jīng)損傷同側(cè)的脊髓背角表達(dá)顯著升高；（10）免疫熒光雙重標(biāo)記顯示pJNK在脊髓背角與GFAP幾乎完全共存；（11）pJNK抑制劑SP600125從SNL3d開始能夠顯著抑制SNL誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛，這種效應(yīng)持續(xù)到術(shù)后10d；（12）NMDA受體非選擇性拮抗劑MK-801以及NR2B亞單位選擇性拮抗劑Ro25-6981和ifenprodil均能有效抑制SNL誘

11、導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛和脊髓背角JNK磷酸化；（13）免疫熒光雙重標(biāo)記顯示NR2B亞單位在脊髓背角與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN大量共存，而NR2B幾乎沒有在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)；（14）NMDA多次注射誘導(dǎo)pJNK在脊髓背角的高表達(dá)，免疫熒光雙重標(biāo)記顯示NMDA誘導(dǎo)的pJNK均表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞；（15）SNL誘導(dǎo)的JNK活化依賴于nNOS，而不依賴于nNOS敏感性的鳥苷酸環(huán)化酶(GC)途徑；（16）阻斷NMDAR-nNOS通路抑制JNK相關(guān)的細(xì)胞因

12、子mRNA表達(dá)；（17）鞘內(nèi)注射NMDAR阻斷劑氯胺酮具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，而且該效應(yīng)呈劑量依賴性，氯胺酮的鎮(zhèn)痛效果出現(xiàn)較快（數(shù)分鐘），但是持續(xù)的時(shí)間較短；（18）鞘內(nèi)注射LAA的鎮(zhèn)痛效果出現(xiàn)較慢，但是持續(xù)的時(shí)間較長；聯(lián)合給藥的作用效果很快即可誘導(dǎo)，并且作用穩(wěn)定而持久；（19）氯胺酮和LAA聯(lián)合給藥時(shí)，LAA能夠促進(jìn)氯胺酮對NR1磷酸化的抑制作用，而氯胺酮能夠促進(jìn)LAA對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用；（20）提出同時(shí)以神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)的聯(lián)

13、合鎮(zhèn)痛手段；（21）預(yù)防性腹腔注射雷公藤提取物T4抑制神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生，治療性腹腔注射T4能夠逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的神經(jīng)病理性痛；（22）T4能夠抑制SNL后脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的活化，但對神經(jīng)元及正常狀態(tài)下的膠質(zhì)細(xì)胞沒有顯著作用；（23）T4處理抑制SNL后脊髓背角絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）的活化；（24）腹腔注射T4抑制SNL后脊髓背角的細(xì)胞因子和趨化因子包括IL-1beta、TNF-alpha、MCP-1以及IL-6等mRNA表達(dá)。<

14、br>　　【結(jié)論】
　?。?）SNL后，同側(cè)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和GLT-1的活躍改變，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　?。?）SNL誘導(dǎo)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯著活化；阻斷神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化能夠緩解疼痛，同時(shí)分別下調(diào)對方的活性；提示在神經(jīng)病理性痛發(fā)展的過程中，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化相互促進(jìn)，兩者以正反饋的方式促進(jìn)神經(jīng)病理性痛的發(fā)生發(fā)展。
　?。?）SNL后脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞

15、JNK的磷酸化水平顯著升高并參與SNL誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛；阻斷NMDAR以細(xì)胞間間接作用的方式抑制脊髓背角JNK磷酸化；SNL誘導(dǎo)的JNK活化依賴于nNOS，但不依賴于nNOS敏感性的GC途徑；阻斷NMDAR-nNOS通路抑制JNK相關(guān)的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)；提示NMDAR-nNOS通路介導(dǎo)了疼痛狀態(tài)下神經(jīng)元向星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號傳遞。
　　（4）鞘內(nèi)聯(lián)合給予氯胺酮和LAA能快速、穩(wěn)定、持久地抑制疼痛行為；氯胺酮和LAA能夠抑制N