神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在大鼠神經(jīng)病理性痛發(fā)生機制中的作用.pdf

1、目的:
　　觀察Neuregulin在大鼠神經(jīng)病理性痛發(fā)生機制中的作用。
　　方法:
　　1.鞘內(nèi)置管注射外源性neuregulin對正常大鼠痛行為的影響
　　60只雄性SD大鼠,隨機分為對照組,實驗組。每組30只,體重180g-200g。實驗組大鼠行枕骨大孔鞘內(nèi)置管手術(shù)后給與外源性neuregulin,對照組給予生理鹽水。置管后將大鼠放入單獨的籠子中觀察3天。枕骨大孔置管3天后,對照組大鼠給予20μl0.9％生

2、理鹽水,實驗組大鼠給予ab55742(外源性的neuregulin,溶解于0.9%的生理鹽水)20μl(1ng/ul)。兩組大鼠均是每天注射兩次,每次20μl。在給藥前1天,給藥后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天進行機械痛閾的測定。在大鼠給藥前,給藥后3天、7天、14天、21天以上各個時間點隨機選出大鼠3只,取L3-L6脊髓組織,部分組織提取總蛋白western-blot分析neuregulin、GFAP的表達。

3、部分組織提取總的RNA,用實時定量PCR測定IL-1β,TNF-α mRNA水平變化。并于第14d取3只老鼠L3-L6脊髓做冰凍切片通過免疫熒光技術(shù)觀察星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學改變。
　　2.阻斷neuregulin/erbb信號通路對神經(jīng)病理性痛模型大鼠痛行為的影響
　　將75只雄性SD大鼠(180g-200g)隨機分為3組,分別是SNL組:僅制備SNL模型;SNL+DMSO組:SNL模型制備后第7天進行鞘內(nèi)置管并給予5%DMS

4、O溶劑20μl(每天2次,每次20μl)和SNL+抑制劑組:在SNL模型制備后的第7天進行鞘內(nèi)置管并給與neuregulin/erbB信號通路抑制劑AG147820μl(1ug/μl),每天2次,每次20μl。觀察三組大鼠置管造模前后以及給藥后大鼠機械痛域變化。Western blot方法檢測三組大鼠在給藥后第14天時間點neuregulin,GFAP在脊髓腰膨大的蛋白水平,實時定量PCR測量IL-1β,TNF-α在脊髓腰膨大mRNA水

5、平。于給藥后第14天取3只大鼠L3-L6脊髓做冰凍切片,運用免疫熒光技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞變化。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組比較,實驗組大鼠給予外源性neuregulin第1天,大鼠的50%縮爪閾值有明顯下降(p<0.05),且疼痛持久。給予外源性neuregulin(ab55742)后,western blot檢測發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠脊髓腰膨大的GFAP,neuregulin蛋白含量比對照組高(p<0.05),實時定量PCR顯示

6、脊髓背角IL-1β,TNF-α mRNA表達也比對照組高(p<0.05)。免疫熒光揭示給藥第14天實驗組大鼠脊髓背角激活的星形膠質(zhì)細胞數(shù)目較對照組增多。
　　2.鞘內(nèi)置管給藥第3天開始,SNL+抑制劑組的大鼠在各個時間點機械刺激50%縮爪閾值分別與SNL組和SNL+DMSO組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。而SNL組和SNL+DMSO組,兩組間各個時點機械刺激50%縮爪閾值差異沒有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。SNL+抑制劑

7、組與其他兩組比較而言,脊髓腰膨大的GFAP,neuregulin蛋白水平表達量低,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);實時定量PCR測定脊髓背角TNF-α,IL-1βmRNA表達低于其他兩組(p<0.05);免疫熒光顯示第14天星形膠質(zhì)細胞數(shù)目減少。
　　結(jié)論:
　　鞘內(nèi)給予激動劑ab55742后導致大鼠50%縮爪閾值下降并導致脊髓水平星形膠質(zhì)細胞激活,IL-1β,TNF-α mRNA表達上調(diào)。拮抗NRG/ERBB信號通路卻可