脊髓甘氨酸能前饋抑制回路LTD在神經病理性痛覺超敏發(fā)生機制中的作用.pdf

1、疼痛閘門控制學說提出近50年以來一直影響著疼痛機制研究領域。然而它提出的閘門控制回路是以假說形式存在,其結構和功能組成一直是未解之謎。本文作者所在課題組長期堅持“閘門控制學說提出的回路是否存在”這一富有挑戰(zhàn)性的課題,最近對脊髓后角痛覺回路和觸覺回路之間的聯系回路的組成和可塑性變化進行了深入研究,本課題組發(fā)現[1]后角III層內接受非傷害性Ab纖維傳入的甘氨酸(Gly)能抑制性神經元和IIi層的PKCg陽性興奮性中間神經元之間存在著直接的

2、抑制性突觸聯系,形成一個前饋式抑制性回路;PKCg陽性中間神經元與位于IIo層的接受痛覺傳入的興奮性中間神經元(TC,中央細胞)形成興奮性突觸聯系,組成了粗纖維介導的非傷害性傳入調控細纖維介導的傷害性傳入的結構基礎。這個甘氨酸能前饋抑制回路發(fā)揮著類似閘門的作用,控制觸覺信息向痛覺通路傳遞,而外周神經損傷可引起這個前饋抑制回路功能降低形成閘門開放效應,使觸覺信息傳遞到痛覺通路產生痛覺超敏(allodynia)現象。
　　“痛覺超敏閘

3、門”是神經病理性疼痛形成的重要機制之一。基于前期研究結果,本課題應用膜片鉗全細胞記錄、形態(tài)學和行為學技術,對“痛覺超敏閘門”在外周神經損傷引起的神經病理性疼痛條件下的開放機制進行了初步探索,本文提出AMPA受體內吞介導的甘氨酸抑制回路 LTD可能是“痛覺超敏閘門”在外周神經損傷引起的神經病理性疼痛條件下的開放機制之一。
　　實驗一:脊髓痛覺超敏閘門回路的突觸可塑性變化及機制研究
　　目的:應用膜片鉗技術,在正常大鼠脊髓切片上

4、研究脊髓痛覺超敏閘門回路的突觸可塑性變化及機制。
　　方法:取4～5周齡雄性SD大鼠脊髓腰膨大段制備帶后根的矢狀面切片。選擇脊髓后角Ⅱ層和Ⅲ層交界處的神經元做全細胞記錄,根據后根刺激反應的潛伏期、誘發(fā)強度等電生理特征選擇需要的神經元。通過高頻電刺激誘發(fā)長時程改變,觀察TAT-GluR2的作用。(1)觀察TAT-GluR2對高頻電刺激誘發(fā)的Ⅲ層甘氨酸能神經元LTD的影響。(2)觀察TAT-GluR2對高頻電刺激誘發(fā)的Ⅱ層PKCγ神經

5、元的長時程改變的影響。
　　結果:高頻刺激后,觸覺通路上的非傷害性Ad纖維與甘氨酸能神經元形成的突觸產生的EPSP(Ab-EPSP)幅度明顯低于刺激前,且持續(xù)至少40min(n=6,P<0.001,one-way AVOVA);甘氨酸能神經元與PKCg神經元形成的抑制性突觸產生的IPSP(unitary IPSP)幅度明顯低于刺激前,且持續(xù)至少40min(n=6,P<0.001,one-way AVOVA)。預灌流Tat-GluR

6、220分鐘明顯抑制了甘氨酸能神經元的EPSP-LTD和PKCg神經元的IPSP-LTD的形成(n=6,P<0.001,one-way AVOVA)。TAT-GluR2S預處理對LTD的形成無明顯影響(n=5,P>0.05,one-way AVOVA)。
　　實驗二: AMPA受體內吞抑制劑TAT-GluR2對SNL大鼠痛覺超敏的影響
　　目的:用行為學方法探討TAT-GluR2對神經病理性疼痛的長時程改變的在體影響。

7、　　方法:建立大鼠SNL模型,蛛網膜下腔置管。通過在SNL之前和SNL引起神經病理性疼痛之后鞘內注射TAT-GluR2觀察局部阻斷AMPA受體內吞對SNL引起的神經病理性疼痛的預防和治療作用。
　　結果:(1)單次注射TAT-GluR2對假手術組動物的痛閾沒有明顯影響(n=6,P>0.05,one-way AVOVA);對SNL動物可以減緩機械性縮足反應閾值的下降速度(n=6,P<0.01,one-way AVOVA)。(2)持續(xù)

8、泵注TAT-GluR2顯著減緩SNL大鼠機械性縮足反應閾值的下降(n=6,P<0.01,one-way AVOVA)。(3)鞘內注射TAT-GluR2對SNL后已經形成的機械性痛敏仍有改善作用并且呈劑量依賴性(n=10,P<0.01,one-way AVOVA)。
　　實驗三: SNL大鼠閘門回路中的GluR2和GlyRα3的定位分布變化
　　目的:觀察SNL大鼠GluR2和GlyRα3分布位置的改變
　　方法:SD大

9、鼠,雄性,180~220g,隨機分成兩組,一組造模,一組空白對照。造模組SNL后7天與空白對照同時取材,固定,冰凍切片,免疫熒光染色雙標(PKCgand GluR2,PKCgand GlyRα3,GlyT2 and GluR2)。
　　結果:正常成年大鼠只有少數PKCγ陽性神經元表達GluR2且主要分布在胞膜;SNL后PKCγ陽性神經元上的GluR2發(fā)生內吞。正常大鼠大多數PKCγ陽性神經元表達GlyRα3且主要分布在胞膜;SNL

10、后PKCγ陽性神經元上的GlyRα3分布無明顯變化。正常大鼠甘氨酸能神經元的GluR2主要分布在胞膜;SNL后甘氨酸能神經元膜上的GluR2發(fā)生內吞。
　　小結:
　　1.電生理實驗結果提示:觸覺通路甘氨酸神經元和PKCg神經元表達通路特異性LTD,甘氨酸能神經元突觸后膜的谷氨酸受體內吞可能是LTD形成的原因。這個抑制通路的LTD使甘氨酸神經元抑制功能降低,進而使PKCγ神經元失去甘氨酸神經元的控制,激活觸覺通路和痛覺通路之

11、間“沉默”的興奮性通路,觸覺信息由此傳入痛覺通路。
　　2.行為學實驗結果提示:抑制AMPA受體內吞可預防或改善外周神經損傷引起的痛覺超敏的發(fā)生。
　　3.形態(tài)學實驗結果提示:甘氨酸能神經元膜上的GluR2內吞可能是甘氨酸抑制性回路LTD及神經損傷后痛覺超敏發(fā)生的主要原因之一,PKCγ陽性神經元膜上的GlyRα3似乎與LTD的發(fā)生無關。
　　結論:AMPA受體內吞介導的甘氨酸抑制回路LTD可能是“痛覺超敏閘門”在外周神