脊髓NG2細(xì)胞在大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain)是神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種難以治療的慢性狀態(tài)，國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（IASP,1994)稱(chēng)之為“由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷或功能紊亂引起的疼痛”。感染、創(chuàng)傷、代謝性疾病、腫瘤化療、手術(shù)、射線(xiàn)、神經(jīng)毒性藥物、神經(jīng)受壓缺血、炎癥和腫瘤的侵襲都可引起神經(jīng)病理性(中樞性和周?chē)?疼痛。
　　 急性疼痛對(duì)機(jī)體具有警示和“保護(hù)”作用，而神經(jīng)病理性疼痛與之不同，它可以

2、持續(xù)存在，對(duì)機(jī)體無(wú)益，甚至?xí)?yán)重影響生活質(zhì)量。神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，從神經(jīng)損傷（傷害性刺激）到疼痛產(chǎn)生，會(huì)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生一系列的變化。脊髓是疼痛信息傳遞和整合的初級(jí)中樞，脊髓背角匯聚著來(lái)自外周的不同傳入神經(jīng)與來(lái)自腦干和大腦皮質(zhì)的下行投射神經(jīng)，加上背角局部中間神經(jīng)元，組成十分復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并含有非常豐富的生物活性物質(zhì)，因此，脊髓在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要

3、的信號(hào)細(xì)胞，而膠質(zhì)細(xì)胞僅僅是起絕緣、營(yíng)養(yǎng)與支持作用，因此，以往在對(duì)疼痛的研究中大量的實(shí)驗(yàn)關(guān)注于神經(jīng)元的功能。
　　 但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的產(chǎn)生與發(fā)展過(guò)程中起重要的作用。Colburn等首次提出小膠質(zhì)細(xì)胞的活化出現(xiàn)在疼痛的起始階段,而星型膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)展和持續(xù)階段有很強(qiáng)的活化反應(yīng)。外周神經(jīng)損傷后初級(jí)傳入神經(jīng)纖維中樞端釋放P物質(zhì)（substance P,SP）、興奮性氨基酸（Excitatory amino acids，

4、EAAs）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）等，作用于脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的受體，膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生和釋放大量疼痛相關(guān)介質(zhì)，如細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)等。過(guò)量的這些物質(zhì)積聚又能敏化神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，最終造成疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和擴(kuò)大，使病理性疼痛進(jìn)一步發(fā)展和持續(xù)。
　　 近年來(lái)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)兼具神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞表面特異性表達(dá)硫酸軟骨素蛋白多糖NG2，被稱(chēng)為NG2細(xì)胞。新

5、近的研究認(rèn)為它是繼少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞后的又一類(lèi)“新型”膠質(zhì)細(xì)胞系，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)與白質(zhì)中。在對(duì)NG2細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷與疾病過(guò)程中可出現(xiàn)NG2細(xì)胞的活化，主要表現(xiàn)為胞體增大，突起增多，NG2分子表達(dá)增多。在海馬區(qū)NG2細(xì)胞與興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元均可形成突觸聯(lián)系，NG2細(xì)胞膜表面的AMPA受體和GABAA 受體參與了由神經(jīng)元到NG2細(xì)胞的信息傳導(dǎo)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病過(guò)程中NG2細(xì)胞可產(chǎn)

6、生和釋放多種神經(jīng)興奮性物質(zhì)。此外，研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NG2分子及炎性介質(zhì)，RNA干擾下調(diào)NG2分子的表達(dá)后，小膠質(zhì)細(xì)胞活化表達(dá)的炎性介質(zhì)下調(diào)。上述研究提示NG2細(xì)胞在神經(jīng)活動(dòng)（包括疼痛的發(fā)生發(fā)展）中可能占據(jù)某種重要的地位，但由于對(duì)該細(xì)胞了解較晚，相關(guān)研究還處在初級(jí)階段。
　　 基于以上理論及研究基礎(chǔ)，本研究擬通過(guò)以下三部分的研究，來(lái)觀察慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NG2細(xì)胞的變化及其參與疼痛的相

7、關(guān)機(jī)制：１：制作大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察大鼠疼痛行為學(xué)的改變（包括機(jī)械刺激50％縮爪閾值和輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間）及大鼠脊髓NG2細(xì)胞及NG2分子表達(dá)變化，初步探討NG2細(xì)胞在慢性神經(jīng)病理性疼痛中的的作用；2：體外培養(yǎng)大鼠NG2細(xì)胞，觀察其膜表面AMPA受體激活后NG2分子與疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)的變化；構(gòu)建大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體，觀察RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達(dá)后，NG2細(xì)胞AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)的改

8、變；3：將大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體注射到慢性神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察脊髓NG2細(xì)胞疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)的變化及其對(duì)疼痛的影響。
　　 研究方法與結(jié)果：1.慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NG2細(xì)胞及NG2分子表達(dá)的變化方法：選擇成年雌性Sprague-Dawlye 大鼠96只，體重220~250g，隨機(jī)分為三組，對(duì)照組（Na?ve組，n=24），不做任何處理；假手術(shù)組（Sham組，n=24），于大鼠背部切開(kāi)皮膚

9、，分離肌肉直至L5橫突，咬開(kāi)橫突，暴露L5脊神經(jīng)后縫合肌肉與皮膚；
　　 神經(jīng)病理性疼痛模型組（Spinal nerve ligation，SNL組，n=48)，于大鼠背部切開(kāi)皮膚,分離肌肉直至L5橫突，咬開(kāi)橫突，暴露L5脊神經(jīng)，用絲線(xiàn)結(jié)扎并剪斷L5脊神經(jīng)，縫合肌肉與皮膚。觀察術(shù)前、術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d的術(shù)側(cè)后趾對(duì)機(jī)械刺激的50％縮爪閾值和輻射熱刺激的縮爪持續(xù)時(shí)間；于相同時(shí)點(diǎn)取脊髓腰膨大組織(每個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選擇4

10、只)，制作冰凍切片后作免疫熒光染色以觀察脊髓腰膨大背角組織中NG2細(xì)胞的改變；同時(shí)于相同時(shí)點(diǎn)提取SNL組大鼠術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織(每個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選擇4只)的蛋白質(zhì)，Western blot分析以檢測(cè)NG2分子的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：術(shù)前各組大鼠術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與術(shù)前相比，Na?ve組與Sham組大鼠各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間差

11、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），SNL組大鼠術(shù)后3天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值明顯降低，輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Sham組相比，SNL組大鼠術(shù)后3天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值明顯降低，輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，SNL組大鼠術(shù)后第7d、14d、21d 術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細(xì)胞明顯活化，可見(jiàn)胞體增大

12、，突起增多。NG2細(xì)胞數(shù)目稍增多，但與術(shù)前相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SNL組大鼠術(shù)后第7d、14d、21d 術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織中NG2的表達(dá)量明顯增加，與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2.體外培養(yǎng)NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)的改變方法：使用percoll不連續(xù)梯度離心法從Sprague-Dawlye大鼠乳鼠海馬中分離培養(yǎng)NG2細(xì)胞，免

13、疫熒光染色鑒定細(xì)胞性質(zhì)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度。構(gòu)建大鼠NG2基因的shRNA慢病毒載體LV-NG2-RNAi及對(duì)照慢病毒載體LV-Con-RNAi，并檢驗(yàn)慢病毒載體的干擾效能。體外培養(yǎng)NG2細(xì)胞接種于6孔板中，分為三組：對(duì)照組（n=12）：不添加任何試劑；AMAP組（n=12）：加入AMPA受體激動(dòng)劑AMPA0.5mM；AMPA+CNQX組（n=12）：同時(shí)加入AMPA受體激動(dòng)劑AMPA0.5mM與AMPA受體拮抗劑CNQX50μM

14、。
　　 于加藥后1h、6h、12h、24h（每時(shí)間點(diǎn)3孔）使用Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞NG2分子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF與細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)的變化。體外培養(yǎng)NG2細(xì)胞接種于6孔板中，分為兩組：對(duì)照組（n=3）：加入LV-Con-RNAi 4d后加入AMPA受體激動(dòng)劑AMPA0.5mM；實(shí)驗(yàn)組（n=3）：加入LV-NG2-RNAi 4d后加入AMPA受體激動(dòng)劑AMPA0.5mM。于加藥后12h使用

15、Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞NG2分子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF與細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：成功體外分離培養(yǎng)了大鼠NG2細(xì)胞，細(xì)胞純度可達(dá)80％以上。構(gòu)建的慢病毒載體LV-NG2-RNAi的滴度可達(dá)8×108 TU/ml，干擾效率可達(dá)80％以上。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NG2細(xì)胞表面AMPA受體活化后NG2、BDNF、NGF在給藥后1h、6h、12h、24h表達(dá)增高，與對(duì)照

16、組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IL-1β在給藥后6h、12h、24h表達(dá)增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α在給藥后1h、6h、12h表達(dá)增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RNA干擾下調(diào)NG2分子表達(dá)后，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NG2細(xì)胞表面AMPA受體活化后NG2表達(dá)降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α

17、表達(dá)降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3.鞘內(nèi)注射N(xiāo)G2-shRNA慢病毒載體對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響方法：選擇成年雌性Sprague-Dawlye大鼠48只，體重220~250g，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組（Na?ve組，n=12）；神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL組，n=12)；鞘內(nèi)注射LV-Con-RNAi后7d制備神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL+Con組，n=12)；鞘內(nèi)注射LV-NG2-RNAi后7d

18、制備神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL+NG2組，n=12)。術(shù)后7d使用western blot 檢測(cè)大鼠脊髓腰膨大組織NG2蛋白的表達(dá)；同時(shí)提取大鼠脊髓腰膨大組織中NG2細(xì)胞，使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)NG2細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF與細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)的變化；于術(shù)前、術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d觀察術(shù)側(cè)后趾對(duì)機(jī)械刺激的50％縮爪閾值和輻射熱刺激的縮爪持續(xù)時(shí)間。
　　 結(jié)果：western blot 檢測(cè)

19、結(jié)果顯示，與Naive組相比，SNL組和SNL+Con組大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2蛋白表達(dá)量增高（P<0.05），SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變（P>0.05）。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Na?ve組比較，SNL組和SNL+Con組大鼠脊髓腰膨大組織NG2細(xì)胞BDNF、NGF表達(dá)增多，但SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大NG2細(xì)胞BDNF、NGF表達(dá)無(wú)明顯改變；與Na?ve組比較，SNL組、SNL+Co

20、n組和SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大組織NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)均增多。行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，術(shù)前各組大鼠術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SNL組與SNL+Con組大鼠從術(shù)后3天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值降低，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SNL+NG2組大鼠從術(shù)后14天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值降低，與Na?ve組比較差

21、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SNL組與SNL+Con組大鼠從術(shù)后3天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間增高，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SNL+NG2組大鼠從術(shù)后7天開(kāi)始各時(shí)點(diǎn)術(shù)側(cè)后肢輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間增高，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差

22、分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究總結(jié)：
　　 一、主要研究結(jié)果1．本研究通過(guò)疼痛行為學(xué)觀察確定成功構(gòu)建了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型。免疫熒光染色顯示，大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細(xì)胞活化，表現(xiàn)為胞體增大，突起增多；Western Blot 檢測(cè)顯示，大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織NG2分子表達(dá)增加。
　　 2．體外成功培養(yǎng)了大鼠NG2細(xì)胞

23、；大鼠NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后NG2分子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF與細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)增高；成功構(gòu)建了大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體；RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達(dá)后，NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α表達(dá)均降低。
　　 3．鞘內(nèi)注射N(xiāo)G2-shRNA 慢病毒載體可以有效下調(diào)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2分子；RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達(dá)

24、后神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大NG2細(xì)胞的BDNF和NGF表達(dá)降低；延遲了神經(jīng)病理性疼痛大鼠術(shù)側(cè)后肢機(jī)械刺激50％縮爪閾值的下降和輻射熱刺激縮爪持續(xù)時(shí)間的增高。
　　 二、研究結(jié)論：
　　 1．神經(jīng)病理性疼痛大鼠術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細(xì)胞活化，參與了疼痛的過(guò)程。
　　 2．體外培養(yǎng)大鼠NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后NG2分子及疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)上調(diào)；NG2分子參與了大鼠NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后

25、的信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程，影響疼痛相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)。
　　 3．下調(diào)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大NG2細(xì)胞的NG2分子表達(dá)可以下調(diào)NG2細(xì)胞BDNF和NGF的表達(dá)，延遲疼痛的發(fā)生。
　　 三、創(chuàng)新之處：
　　 1．近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NG2細(xì)胞參與多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷與疾病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)首次觀察了大鼠L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型中脊髓腰膨大NG2細(xì)胞與NG2分子的改變，初步證實(shí)NG2細(xì)胞參與了疼痛的過(guò)程。
　　 2．文獻(xiàn)報(bào)

26、道NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，但并沒(méi)有相關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察其后的生物效能（包括基因表達(dá)變化）。本實(shí)驗(yàn)觀察了AMPA 受體活化后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子表達(dá)的改變，并且觀察了NG2分子表達(dá)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 四、展望：
　　 1．本研究發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的過(guò)程中脊髓NG2細(xì)胞活化，NG2分子參與了NG2細(xì)胞表面AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達(dá)的過(guò)程，但是NG2分子與