脊髓背角HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、外周神經(jīng)損傷后造成的神經(jīng)病理性疼痛是臨床上多見而難以治療的慢性疾痛，對人們的身體健康造成嚴(yán)重影響。因此，揭示其發(fā)生機(jī)制、進(jìn)一步研發(fā)效果良好而副作用小的鎮(zhèn)痛藥物是疼痛研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。以往研究表明，外周神經(jīng)損傷引起的背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角神經(jīng)元興奮性增高是產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵。脊髓背角是痛覺傳導(dǎo)過程中重要的整合中樞，新近研究發(fā)現(xiàn)，分布于脊髓背角的超極化激活環(huán)核苷酸門控( hyperpolarization-activated cyclic

2、 nucleotide gated, HCN)通道在病理性疼痛的調(diào)節(jié)起重要作用，但其機(jī)制不清楚。此外，嘌呤能 P2X受體與疼痛密切相關(guān)，研究表明表達(dá)于脊髓背角神經(jīng)元的P2X受體的激活促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。HCN通道與P2X受體均表達(dá)于脊髓背角神經(jīng)元，那么，HCN通道是否通過影響背角神經(jīng)元P2X受體的功能，進(jìn)一步調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性及傷害性信息的傳遞，目前尚不清楚。本課題通過制作大鼠坐骨神經(jīng)痛模型，結(jié)合在體和離體研究，綜合應(yīng)用行為學(xué)

3、、分子生物學(xué)等方法，從以下幾個方面進(jìn)行觀察：1） HCN通道在坐骨神經(jīng)縮窄性損傷（chronic constriction injury，CCI）所引起的神經(jīng)痛中的作用；2）HCN通道是否調(diào)節(jié)CCI大鼠脊髓背角神經(jīng)元P2X受體的表達(dá)；3）HCN通道對培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元P2X受體功能的影響。本課題從不同角度探討HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及相關(guān)機(jī)制，為開發(fā)以HCN通道為靶點(diǎn)的新型鎮(zhèn)痛藥提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1

4、.觀察脊髓背角神經(jīng)元HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛中的作用；
　　2.觀察HCN通道對培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元P2X受體功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.在體實(shí)驗(yàn)：7～8周齡成年SD大鼠（雄性）48只隨機(jī)分為6組：(1)sham組(假手術(shù)組)、(2)CCI組(鞘內(nèi)注射生理鹽水)、(3)~(6) CCI+ZD7288(鞘內(nèi)分別注射1,10,30,50μg ZD7288)，每組8只。CCI及CCI+ZD7288組大鼠在鞘

5、內(nèi)置管恢復(fù)5d后給予CCI術(shù)，術(shù)后鞘內(nèi)給藥（2次/日，持續(xù)14d）；sham組大鼠不進(jìn)行鞘內(nèi)置管，僅游離坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎。行為學(xué)檢測：熱痛閾測定；免疫印跡技術(shù)檢測：脊髓背角HCN1,3,4通道、P2X2,6受體、P-PKA蛋白表達(dá)水平；
　　2.離體實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)出生三天以內(nèi)的SD乳鼠脊髓背角神經(jīng)元，分為7組：①對照組；②ATP組（100μmol/L）；③無鈣液+ATP組，無鈣液預(yù)先孵育20min，再加入ATP；④TNP-ATP（10

6、μmol/L）+ATP組， TNP-ATP預(yù)先孵育10min，再加入ATP；⑤ZD7288（1,10,100,1000umol/L）+ATP組，不同濃度ZD7288先孵育10min，再加ATP；⑥8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP組；⑦ZD7288（100μmol/L）+8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP組，先加ZD7288孵育10min，再加cAMP孵育10min，最后加ATP。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察

7、神經(jīng)元[Ca2+]i的動態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠CCI術(shù)后即第1d即形成穩(wěn)定的熱痛敏，至第14d熱痛敏仍持續(xù)存在，TWL明顯縮短（P＜0.05）；鞘內(nèi)給予30μg HCN通道阻滯劑ZD7288可明顯延長CCI大鼠的TWL（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果顯示，CCI組大鼠在術(shù)后7、14 d術(shù)側(cè)脊髓背角HCN1,3,4、P2X2,6及P-PKA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；鞘內(nèi)給予ZD7288可顯著降低C

8、CI大鼠HCN1,3,4,P2X2,6及P-PKA的表達(dá)（P＜0.05）。
　　2.ATP（100μmol/L）可導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高，是由 P2X受體介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流所致（P＜0.05）；HCN通道拮抗劑ZD7288（10-1000μmol/L，預(yù)孵育10min）可抑制ATP（100μmol/L）引起的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性；8-Br-cAMP（cAMP類似物,100μmol/

9、L）可增強(qiáng)ATP引起的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高，ZD7288（預(yù)孵育10min）可顯著抑制8-Br-cAMP的效應(yīng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.脊髓背角HCN通道的激活可促進(jìn)CCI所致的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持；同時，神經(jīng)痛時脊髓背角HCN通道的激活可促進(jìn)嘌呤能P2X受體的表達(dá)。
　　2.HCN通道拮抗劑ZD7288顯著抑制脊髓背角神經(jīng)元P2X受體誘發(fā)的[Ca2+]i升高，說明脊髓背角神經(jīng)元HCN通