阿霉素對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療作用及其機制.pdf

1、目的：神經(jīng)病理性疼痛通常病程較長，給患者帶來極大的痛苦。阿霉素（DOX）是臨床常用的抗惡性腫瘤藥物，具有廣泛的細胞毒和神經(jīng)毒性作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其可逆行性軸漿運輸，并對外周感覺神經(jīng)有高度選擇性。阿霉素局部應(yīng)用能破壞感覺神經(jīng)節(jié)，起到類似手術(shù)切除的作用，可用于外周神經(jīng)病理性疼痛的治療，療效顯著。但其機制目前尚不完全明確。在本研究中，擬采用大鼠慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷（CCI）模型，觀察阿霉素的鎮(zhèn)痛作用，并從血清酶學(xué)、 DRG的形態(tài)學(xué)及組

2、織凋亡蛋白的角度對其機制進行分析。
　　方法：選擇12只清潔級成年雄性 SD大鼠，體重200-220 g。隨機分為兩組，分別為 DOX5 mg/kg組和和正常對照組，每組6只。2組均采用尾靜脈注射法給藥，對照組給予等量生理鹽水。2小時后分別取出每只大鼠右側(cè) L4-5 DRG制成冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察DOX的熒光表達；另外選取60只清潔級成年雄性SD大鼠，體重200-220 g。隨機分為A組（假手術(shù)組，SHAM，n=15），B組

3、（手術(shù)模型組，MODEL，n=15），C組（假手術(shù)+阿霉素5 mg/kg組，SHAM+DOX，n=15）和 D組（手術(shù)模型+阿霉素5 mg/kg組，MODEL+DOX，n=15）。實驗前，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。B組和D組暴露并結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)以建立CCI手術(shù)模型，A組和C組僅暴露但不結(jié)扎坐骨神經(jīng)以制備假手術(shù)模型。分別在手術(shù)后1、3、5及7天測定各組大鼠機械痛閾值及熱痛閾值。于手術(shù)后第7天 B組和 D組機械痛閾值和熱痛閾值均較手術(shù)前明顯降低，提

4、示 CCI模型成功建立。于手術(shù)后第8天開始給藥，C組和 D組給予 DOX5 mg/kg，另外兩組注射相同體積的生理鹽水，各組均采用尾靜脈注射給藥。給藥后第1、3及6天再次測定各組大鼠機械痛閾值及熱痛閾值。給藥后第7天，取血，分離血清備 SOD活性和 MDA水平測定，之后取出大鼠右側(cè) L4-5 DRG，部分組織經(jīng)甲醛固定后石蠟切片進行 HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察 DRG細胞的變化；部分組織經(jīng)戊二醛固定后送電鏡室，電子顯微鏡下觀察 DRG&

5、nbsp;細胞超微結(jié)構(gòu)的變化；提取 DRG組織的總蛋白，采用 Western blot的方法測定 Bax、Bcl2、PKCɑ、PKCδ及 PKCε的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.DOX在DRG內(nèi)的熒光表達取大鼠右側(cè) L4-5 DRG，立刻制作冰凍切片，切片后12 h內(nèi)在熒光顯微鏡（激發(fā)光波長為488 nm的氬離子激光）下觀察細胞的熒光情況。DOX組相較于對照組出現(xiàn)明顯的紅色熒光。表明阿霉素靜脈給藥可以到達并聚集于DRG。<

6、br>　　2.DOX對CCI模型大鼠機械痛閾和熱痛閾值的影響和 A組（SHAM）相比，C組（SHAM+DOX）在整個實驗期間機械痛域值和熱痛閾值均未見明顯改變,而 B組（MODEL）大鼠于術(shù)后第7天對機械性疼痛和熱痛的敏感性均增加，表現(xiàn)為痛閾值的降低，并且在之后的觀察期持續(xù)存在，提示 CCI模型的成功建立。手術(shù)后第8天給予 DOX，和 B組（MODEL）相比，D組（MODEL+DOX）在給藥后的1，3及6天，大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值均

7、明顯回升。
　　3.DOX對CCI模型大鼠DRG細胞形態(tài)的影響A組（SHAM）細胞形態(tài)完整、排列整齊；B組（MODEL）細胞輕度腫脹、排列整齊；C組（SHAM+DOX）細胞間質(zhì)炎細胞浸潤，胞漿皺縮，出現(xiàn)部分核固縮和核溶解；D組（MODEL+DOX）胞漿嚴重皺縮，部分細胞壞死或變性，部分細胞出現(xiàn)核溶解。表明 DOX可使DRG細胞發(fā)生明顯的變性和壞死。
　　4.DOX對CCI模型大鼠DRG細胞超微結(jié)構(gòu)的影響A組（SHAM）細胞核

8、膜完整，未發(fā)現(xiàn)固縮現(xiàn)象；B組（MODEL）核膜完整未發(fā)現(xiàn)固縮現(xiàn)象，線粒體輕度擴張。；C組（SHAM+DOX）細胞核膜彎曲伴核固縮，線粒體空泡化，內(nèi)部絲樣化結(jié)構(gòu)增多，伴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；D組（MODEL+DOX）核膜彎曲，有核固縮現(xiàn)象。線粒體嵴和膜融合或消失，部分呈空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。表明 DOX可影響DRG細胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　5.DOX對CCI模型大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響和 A組（SHAM）相比，B組（MODEL）血清中的

9、SOD活性和 MDA水平未見明顯改變，而 C組（SHAM+DOX）的SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高。相較于B組（MODEL），D組（MODEL+DOX）的SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增加。
　　6.DOX對CCI模型大鼠Bax/Bcl-2的影響和 A組（SHAM）相比較，B組（MODEL） Bax/Bcl-2未見明顯變化，而 C組（SHAM+DOX）Bax/Bcl-2明顯升高。相較于B組（MODEL），D組（MODE

10、L+DOX）的Bax/Bcl-2值顯著增高。
　　7 DOX對CCI模型大鼠PKCɑ、PKCδ及PKCε蛋白表達的影響PKCɑ在四組中的表達無顯著性變化。和A組（SHAM）相比，B組（MODEL）的PKCδ和 PKCε的表達無顯著性變化，而 C組（SHAM+DOX）的表達量則明顯降低。相較于B組（MODEL）， D組（MODEL+DOX）PKCδ和PKCε的蛋白表達量顯著下降。
　　結(jié)論：DOX靜脈注射可以到達并蓄積于DRG