坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF引起大鼠神經(jīng)病理性疼痛及其機制.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷常常會引起神經(jīng)病理性疼痛，主要表現(xiàn)為痛超敏，即痛閾下降；痛覺過敏，即痛反應增強和自發(fā)性疼痛。但迄今為止，神經(jīng)病理性疼痛的機制仍然不清楚。 最近的研究表明炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。抑制TNF-α的合成或拮抗其受體可減輕神經(jīng)病理性疼痛。坐骨神經(jīng)內(nèi)注射低劑量的TNF可以引起大鼠機械性痛閾下降和熱痛反應增強，持續(xù)

2、時間為幾天。但是，TNF-α在體內(nèi)的半衰期只有十幾分鐘，注射一次生理濃度的TNF-α為什么會引起如此長時間的病理性疼痛還不是很清楚。 以前的研究表明神經(jīng)損傷可導致背根神經(jīng)節(jié)(DRG)TNF-α及其受體1(TNFreceptor 1，TNFR1)的增加，而且許多表達有TNF-α的神經(jīng)元同時表達有大量的TNFR1。這提示TNF-α可能是通過自分泌途徑以引起神經(jīng)病理性疼痛。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)周圍給予10，100，1000 p

3、g/ml重組大鼠腫瘤壞死因子(rrTNF，recombinant rat TNF-α，每天一次，共2天)可引起大鼠雙側(cè)后爪機械性痛閾下降和熱痛反應增強，即鏡像痛，持續(xù)約20天。然后在坐骨神經(jīng)周圍施加100 pg/ml rrTNF(Peri-sciatic administration ofrrTNF，以下簡稱PST)后不同時間點，用免疫組織化學方法檢測了L4，L5 DRG及腰膨大脊髓背角TNF-α及其受體1的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同側(cè)(非對

4、側(cè))L4，L5 DRG TNF-α及其受體1的免疫活性分別于給藥后第1，3天增高。免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)增高的TNF-α免疫活性主要位于DRG的神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星細胞，而受體1主要位于神經(jīng)元。腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α免疫活性第3天開始顯著增加，一直持續(xù)到第14天，位于膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。TNFR1免疫活性在給藥后一直未發(fā)生顯著變化。另外，我們還發(fā)現(xiàn)PST后6天，同側(cè)L4，L5 DRG內(nèi)Nav1.3表達顯著增強。實驗最后還觀察到PST前30

5、分鐘，鞘內(nèi)注射NF-kB抑制劑PDTC可完全抑制rrTNF誘導的機械痛敏及TNF-α，TNFR1的表達增高。這些結(jié)果提示外源性的低劑量TNF-α可能是通過自分泌途徑，也就是說可能是通過先作用于感覺神經(jīng)元上的TNFR1，然后激活NF-kB信號通路，從而引起自身的產(chǎn)量增加以引起大鼠長時間的機械刺激痛覺過敏。 第1部分坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF引起大鼠雙側(cè)后爪機械刺激和熱刺激痛覺過敏。最近的研究表明炎癥細胞因子，如TNF-α在神經(jīng)病理

6、性疼痛的產(chǎn)生過程中起作用。抑制TNF-α的合成或拮抗TNF-α的受體可以減輕病理性疼痛。大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)注射TNF可以引起機械性痛閾下降和熱痛反應增強，持續(xù)時間為幾天。但坐骨神經(jīng)內(nèi)膜注射也會損傷神經(jīng)。在完全沒有神經(jīng)損傷的情況下，單純外源性TNF-α是否能引起神經(jīng)病理性疼痛還不清楚。本研究擬用行為學測試的方法觀察坐骨神經(jīng)周圍給予重組大鼠TNF-α是否能產(chǎn)生類似于神經(jīng)損傷以后的痛行為學變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10， 100，1000 pg/ml r

7、rTNF(每天一次，共2天)可引起大鼠雙側(cè)后爪機械性痛閾下降和熱反應增強，持續(xù)約20天。坐骨神經(jīng)周圍給予1pg/mlrrTNF后，大鼠雙側(cè)后爪50﹪機械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無變化。100pg/ml組與1000 pg/ml組產(chǎn)生的機械性刺激與熱刺激痛覺過敏的程度無明顯差別。坐骨神經(jīng)周圍給予200μl 0.1﹪BSA(rrTNF溶劑)對大鼠雙側(cè)后爪50﹪機械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無任何影響。肌肉內(nèi)(靠近而不接觸坐骨神經(jīng))給予rrT

8、NF(1000 pg/ml，200 μl，每天一次，共兩天)對大鼠雙側(cè)后爪50﹪機械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無影響。上述結(jié)果提示在完全不損傷神經(jīng)的情況下，坐骨神經(jīng)周圍給予低劑量的rrTNF可通過神經(jīng)途徑而不是血液途徑引起神經(jīng)病理。 第2部分坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF引起TNF-α及TNFR1在背根神經(jīng)節(jié)和TNF-α在脊髓背角的表達增高。本實驗第一部分已經(jīng)觀察到rrTNF可引起大鼠雙側(cè)后爪機械痛閾下降和熱刺激反應增強。以前有實驗

9、報道向坐骨神經(jīng)施加TNF-α可引起Aδ纖維和C纖維的自發(fā)放電。離體時TNF可引起正常DRG神經(jīng)元短時間放電。很明顯細胞因子對痛覺傳導通路中神經(jīng)元的急性興奮作用在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生中起作用。然而，TNF-α的半衰期只有十幾分鐘，如此低劑量的rrTNF是如何引起長達20天的神經(jīng)病理性疼痛的呢?以前的研究發(fā)現(xiàn)通過腰5前根切除以選擇性的損傷運動神經(jīng)纖維而不損傷感覺神經(jīng)元，也可以使大鼠產(chǎn)生雙側(cè)后爪神經(jīng)病理性疼痛的行為學變化，同側(cè)L4和L5 DR

10、G及雙側(cè)腰五脊髓背角的TNF-α及TNFR1明顯增高。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)DRG的大多數(shù)神經(jīng)元表達有過量TNF-α的同時也表達有大量TNFR1。這提示TNF-α可能通過自分泌途徑以發(fā)揮作用。因此在這部分實驗中，我們在施加100 pg/ml rrTNF后不同時間點，用免疫組織化學和免疫熒光雙染的方法檢測L4，L5 DRG及脊髓背角TNF-α及其受體1的表達情況和細胞類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PST可引起TNF-α及其受體l在同側(cè)L4，L5 DRG和

11、TNF-α在腰膨大雙側(cè)脊髓背角的增高。在DRG，與對照組相比，PST后1天，TNF-α的免疫活性開始增高，3天時其受體1的免疫活性開始增高，6天時達到高峰，顯著性差異可維持2周左右。免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)增多的TNF-α主要位于神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星細胞，而受體1的上調(diào)僅局限于神經(jīng)元。在脊髓，PST后3天，腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α免疫活性陽性面積百分比顯著增加，維持至第14天。免疫雙染發(fā)現(xiàn)TNF-α的上調(diào)既可見于膠質(zhì)細胞，也可見于神經(jīng)元。以

12、上結(jié)果說明外源性TNF-α可引起TNF-α及其受體1的增多，也就是說坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF可能是通過自分泌途徑引起病理性疼痛的。 第3部分NF-kB信號轉(zhuǎn)導途徑在坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF引起痛覺過敏中的作用。TNF-α與其受體1結(jié)合以后，主要通過激活NF-kB信號轉(zhuǎn)導途徑以發(fā)揮作用。在這部分實驗中，我們首先觀察了NF-kB的抑制劑，PDTC對rrTNF引起機械性痛敏和熱痛敏的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每次坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF前3

13、0分鐘鞘內(nèi)注射PDTC(8.2 ng/10μl)可完全防止大鼠雙側(cè)后爪50﹪機械刺激撤足閾值的下降，而熱刺激撤足潛伏期的下降也顯著延遲；相反的，第一次坐骨神經(jīng)周圍給予rrTNF后6天，再鞘內(nèi)給予同等劑量的PDTC對已經(jīng)形成的機械性痛敏無作用，對熱痛敏卻有短暫的抑制作用，鞘內(nèi)注射生理鹽水對rrTNF引起機械痛敏和熱痛敏無顯著影響。PST前給予PDTC可能是通過抑制TNF-α及TNFR1的增高以阻止機械性痛覺過敏的產(chǎn)生的，因此我們進一步在6

14、只PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC的大鼠上進行了實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此組大鼠L5 DRG的TNF-α，TNFR1免疫活性和脊髓的TNF-α免疫活性均顯著下降。此結(jié)果提示TNF-α與NF-kB之間的正反饋可能在rrTNF引起的大鼠機械刺激痛覺過敏的產(chǎn)生中起重要作用。外源性TNF-α僅通過激活NF-kB以引起內(nèi)源性的TNF-α增加從而引起神經(jīng)病理性疼痛。 結(jié)論： 1.在完全不損傷神經(jīng)的情況下，坐骨神經(jīng)周圍給予低劑量的重組大鼠腫瘤壞

15、死因子-α可引起大鼠雙側(cè)后爪機械刺激和熱刺激痛覺過敏，持續(xù)約20天。(我們把這一模型命名為PST模型)2. PST可引起TNF-α，TNFR1在同側(cè)L4，L5 DRG以及TNF-α在腰膨大雙側(cè)脊髓背角的表達增高。 3.PST引起的TNF-α表達增強，在DRG主要位于神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星樣膠質(zhì)細胞，在脊髓背角也發(fā)現(xiàn)于膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。但TNFR1的上調(diào)僅存在于DRG神經(jīng)元。 4.PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC可完全防止r

16、rTNF引起機械性痛閾下降，而PST后6天給予同等劑量的PDTC對已經(jīng)形成的機械性痛覺過敏無作用。說明NF-kB途徑的激活可能在大鼠機械刺激痛覺過敏的產(chǎn)生過程中起作用，而在維持中不起作用。 5.PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC可顯著降低rrlNF所引起L5 DRG TNF-α，TNFR1的增高，及腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α的增高。 6.TNF-α可能是通過自分泌途徑，也就是說TNF-α可能是作用于感覺神經(jīng)元上持續(xù)表達的