SNAP25對(duì)神經(jīng)病理性疼痛興奮抑制失衡作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)病理性疼痛由中樞或者外周軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而導(dǎo)致的疼痛。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，疼痛信號(hào)的傳遞通過(guò)遞質(zhì)的釋放和清除完成，這一過(guò)程連續(xù)而精確。其中遞質(zhì)釋放主要依賴于形成SNARE復(fù)合物，而遞質(zhì)清除則通過(guò)一系列特異性的遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體完成(如興奮性遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GT和抑制性遞質(zhì)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT-1)。神經(jīng)病理性疼痛中存在興奮性遞質(zhì)過(guò)度激活和抑制性遞質(zhì)缺失的現(xiàn)象，稱之為興奮抑制失衡。SNAP-25是SNARE復(fù)合物

2、三種蛋白之一，因此能調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放。GLT則是清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸間隙中谷氨酸最重要的兩種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體之一。SNAP-25在神經(jīng)病理性疼痛中對(duì)遞質(zhì)釋放的作用，及其對(duì)GLT和GAT介導(dǎo)遞質(zhì)清除的影響，尚待研究。
　　目的：
　　構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型，鞘內(nèi)注射A型肉毒素降低SNAP-25的表達(dá)，動(dòng)態(tài)觀察大鼠疼痛行為學(xué)的變化與SNAP-25表達(dá)水平的關(guān)系

3、，檢測(cè)興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT及抑制性GABA遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT的變化，探討探索SNAP-25對(duì)興奮性和抑制性遞質(zhì)釋放和后續(xù)清除的調(diào)控機(jī)制，了解其對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療機(jī)制。
　　方法：
　　1.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性SD成年大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)+生理鹽水組（sham+NS組）、CCI+生理鹽水組(CCI+NS組）、CCI+BoNT/A0.01U組（CCI+BoNT/A組）。CCI組按照Bennett和Xie的方法建立大鼠

4、左側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型，假手術(shù)組僅暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)不結(jié)扎，術(shù)前及術(shù)后3、5、7、10、14天進(jìn)行機(jī)械痛閾、熱痛閾檢測(cè)。術(shù)后14天測(cè)試后于深麻醉下處死取脊髓腰膨大段行Western-blot以及RT-PCR測(cè)定。
　　2.所有大鼠術(shù)后14天測(cè)試后于深麻醉下處死取脊髓腰膨大段行GLT的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測(cè)興奮性谷氨酸

5、遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT和離子型谷氨酸受體NMDA中NR2B亞基的表達(dá)變化。
　　3.大鼠術(shù)后14天測(cè)試完畢后于深麻醉下處死，取脊髓腰膨大段采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白印跡(western blot)方法檢測(cè)抑制性GABA遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.術(shù)前兩組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾無(wú)明顯

6、差別(P＞0.05)，術(shù)后第3天，相對(duì)于sham組，CCI組機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯下降(P＜0.05)，并于術(shù)后第7天降至最低點(diǎn)(P＜0.05)，下降持續(xù)至第14天。鞘內(nèi)單次注射A型肉毒素0.01u后能明顯緩解CCI大鼠的疼痛，CCI+BoNT/A組給藥后第2天/術(shù)后第5天，機(jī)械痛閾和熱痛閾較CCI+NS組明顯升高并持續(xù)至第14天。術(shù)后14天RT-PCR和Western blot檢測(cè)大鼠脊髓腰膨大處SNAP-25的mRNA和蛋白水平，CC

7、I+NS組比Sham組SNAP-25的表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，鞘內(nèi)注射A型肉毒素后，CCI+BoNT/A組表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　2.術(shù)后14天RT-PCR檢測(cè)大鼠脊髓腰膨大處GLT和NR2B的mRNA表達(dá)水平，CCI+NS組比Sham組GLT水平明顯降低(P＜0.05)，而NR2B表達(dá)明顯升高(P＜0.05);鞘內(nèi)注射A型肉毒素后，CCI+BoNT/A組GLT表達(dá)水平上升(P＜0.05)而NR2B表達(dá)水平下降

8、(P＜0.05)。
　　3.術(shù)后14天RT-PCR和Western blot檢測(cè)大鼠脊髓腰膨大處GAT-1的mRNA和蛋白水平，CCI+NS組比Sham組GAT-1的表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，鞘內(nèi)注射A型肉毒素后，CCI+BoNT/A組表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。脊髓腰膨大處免疫組化顯示GAT-1在全脊髓中均有表達(dá)，其中灰質(zhì)表達(dá)為主，在脊髓背角淺層致密表達(dá)。CCI組脊髓背角淺層處GAT-1較sham組表達(dá)明顯增多。經(jīng)肉毒

9、素處理后表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓SNAP-25表達(dá)明顯增加，其表達(dá)水平的變化與大鼠的疼痛學(xué)行為變化相平行。提示SNAP-25可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。
　　2.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓GLT表達(dá)減少和NR2B表達(dá)增多，提示興奮性遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)降低，導(dǎo)致興奮性遞質(zhì)在突觸間隙的累積，過(guò)度激活NMDA受體，是神經(jīng)病理性疼痛形成原因之一。SNAP-25被A型肉毒素BoNT/A分解