大鼠脊髓HMGB1參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展.pdf

1、疼痛（pain）已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為除體溫、呼吸、脈搏、血壓外的第五大生命體征，其中神經(jīng)病理性痛（NeuropathicPain，NP）則被認(rèn)為是最常見(jiàn)、最頑固、最難治的疾病。國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（IASP）將神經(jīng)病理性痛定義更新為：由于感覺(jué)神經(jīng)損傷或疾病直接導(dǎo)致的疼痛。目前世界上約有兩億五千萬(wàn)人倍受神經(jīng)病理性疼痛的折磨，但其治療效果卻不盡如人意，因此神經(jīng)病理性疼痛治療已經(jīng)成為亟待攻克的問(wèn)題之一。神經(jīng)病理性痛的發(fā)生與免疫炎癥緊密

2、相關(guān)，致炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等在神經(jīng)病理性疼痛形成中扮演著重要角色。然而針對(duì)以上炎癥因子治療神經(jīng)病理性的效果仍然不佳，且存在治療時(shí)間窗窄等問(wèn)題。高遷移率蛋白（HMGB1，highmobilitygroupbox-1）被稱(chēng)為晚期炎癥因子，是存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白結(jié)合蛋白，生理狀態(tài)下主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，而在一些病理?xiàng)l件下則釋放到細(xì)胞核外，發(fā)揮晚期炎癥因子的作用。本課題初步探討了大鼠脊髓水平HMGB1在外周神經(jīng)損傷

3、引起的神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一：?jiǎn)未吻蕛?nèi)注射HMGB1重組蛋白誘發(fā)大鼠長(zhǎng)時(shí)程的痛覺(jué)超敏
　　目的：鞘內(nèi)注射HMGB1重組蛋白結(jié)合疼痛行為學(xué)測(cè)試，觀測(cè)HMGB1是否引起大鼠痛覺(jué)敏化，初步建立HMGB1與神經(jīng)病理性痛的相關(guān)性。
　　方法：鞘內(nèi)注射參照J(rèn)asmin等的方法。雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，每組4只（n=8）：NS組（對(duì)照組）：鞘內(nèi)注射無(wú)菌生理鹽水；A組：鞘內(nèi)注射1μgHMGB1重組蛋白；B

4、組：鞘內(nèi)注射10μgHMGB1重組蛋白。用vonFrey測(cè)定大鼠機(jī)械性縮足閾值（mechanicalwithdrawalthreshold,MWT），測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為給藥前及給藥后1h、1d、3d、7d、14d、21d以及28d。
　　結(jié)果：相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組，兩組鞘內(nèi)注射HMGB1重組蛋白均能使大鼠機(jī)械性縮足閾值降低，其中A組在給藥7d到測(cè)試結(jié)束時(shí)機(jī)械縮足閾值均明顯下降(P<0.01)，B組在給藥后1h即顯著降低(P<0.01

5、)，且痛覺(jué)敏感至少持續(xù)到給藥后28d(P<0.01)，這種疼痛反應(yīng)與SNL模型后痛域下降極為相似。
　　實(shí)驗(yàn)二：HMGB1主要表達(dá)于脊髓神經(jīng)元，幾乎不表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞
　　目的：觀察脊髓水平HMGB1的分布和細(xì)胞定位。
　　方法：用免疫熒光雙標(biāo)方法觀察HMGB1在脊髓細(xì)胞水平的定位。健康180～220g的SD雄性大鼠6只，取4％多聚甲醛固定好的大鼠脊髓腰膨大部分，用恒冷箱冰凍切片，用兔抗HMGB1分別與小

6、鼠抗NeuN、小鼠抗GFAP和小鼠抗OX42雙重標(biāo)記，再用Alex488抗兔和Alex594抗小鼠抗體標(biāo)記，最后在免疫熒光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
　　結(jié)果：大鼠脊髓水平HMGB1主要表達(dá)于NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元，在GFAP和OX42陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)極少。
　　實(shí)驗(yàn)三：神經(jīng)病理性痛模型大鼠脊髓水平HMGB1的表達(dá)變化
　　目的：觀察神經(jīng)病理性痛模型大鼠脊髓水平HMGB1的表達(dá)變化。
　　方法：用WesternBlot方

7、法檢測(cè)大鼠脊髓HMGB1在術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。健康雄性180～220gSD大鼠42只，隨機(jī)均分為對(duì)照組(n=6)，SNL模型組(n=6)，分別于術(shù)前（control組）、術(shù)后的1d、3d、7d、14d、21d和28d，首先用預(yù)冷的生理鹽水灌注，低溫下切取大鼠的脊髓新鮮標(biāo)本，用試劑盒提取全蛋白，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，用5％牛奶封閉，在4℃下孵育一抗兔抗HMGB1或小鼠抗β-actin，二抗用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗兔或者抗小鼠的抗體結(jié)合