NRg-1β對CS2誘發(fā)的初級傳入神經元毒性的神經保護作用.pdf

1、二硫化碳(carbon disulfide，CS2)是一種在工業(yè)上應用的無色有機溶劑，可對周圍神經系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)產生毒性作用。雖然CS2所致的神經毒性已遠遠超過一個世紀之久，然而迄今為止，CS2所致神經毒性的作用機制至今尚未被完全闡明。神經調節(jié)蛋白(neuregulin-1β，NRG-1β)可對神經元產生多種調節(jié)作用。NRG-1β是否能夠調節(jié)DRG神經元的生長與遷移目前仍不清楚。本研究

2、利用器官型培養(yǎng)的胎鼠背根神經節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)組織塊培養(yǎng)模型，對CS2的神經毒性作用和NRG-1β神經保護作用進行了系列研究。
　　 第一部分二硫化碳對背根神經節(jié)神經元生長和遷移的抑制作用
　　 為了檢測CS2的神經毒性作用，器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1)0.01 mmol/L CS2組:DRG組織塊用0.01 mmol/L CS2孵育;
　　 (

3、2)0.1 mmol/LCS2組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2孵育;
　　 (3)1.0 mmol/L CS2組:DRG組織塊用1.0mmol/L CS2孵育;
　　 (4)對照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內孵育作為對照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測神經元突起的生長，用微觀相關蛋白-2(microtubule-associated protein 2，MAP2)進行免疫熒光標記，檢測D

4、RG神經元的遷移。結果顯示，0.01 mmol/L CS2孵育的標本，神經纖維束的數目為15.00±2.61條;0.1 mmol/L CS2孵育的標本，神經纖維束的數目為11.17±1.47條;1.0mmol/L CS2孵育的標本，神經纖維束的數目為8.00±1.41條;對照組神經纖維束的數目為17.83±2.48條。經統(tǒng)計學分析，0.01 mmol/L CS2孵育的標本的神經纖維束的數目與對照組相比P＜0.05，0.1 mmol/L和

5、1.0 mmol/L CS2孵育的標本的神經纖維束的數目與對照組相比P＜0.001。0.01 mmol/L CS2孵育的標本，遷移神經元的數目為79.50±9.40個;0.1 mmol/LCS2孵育的標本，遷移神經元的數目為62.50±14.15;1.0 mmol/L CS2孵育的標本，遷移神經元的數目為34.67±7.58;對照組遷移神經元的數目為99.33±15.16。經統(tǒng)計學分析，0.01 mmol/L CS2孵育的標本的遷移神經

6、元數目與對照組相比P＜0.01，0.1 mmol/L和1.0 mmol/LCS2孵育的標本的遷移神經元數目與對照組相比P＜0.001。這些結果表明CS2對DRG神經元突起生長和神經元遷移具有抑制作用并呈劑量依賴關系。
　　 第二部分神經調節(jié)蛋白-1β對背根神經節(jié)神經元生長和遷移的調節(jié)作用
　　 器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1)5 nmol/L NRG-1β組:DRG組織塊用5 nmol/L N

7、RG-1β孵育;
　　 (2)10 nmol/LNRG-1β組:DRG組織塊用10nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (3)20 nmol/L NRG-1β組:DRG組織塊用20 nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (4)對照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內孵育作為對照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測神經元突起的生長，用神經絲蛋白-200(neurofilament 200，NF-200

8、)進行免疫熒光標記，檢測DRG神經元的遷移。結果顯示，5 nmol/LNRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為23.0土2.2條;10 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為27.0±2.7條;20 nmol/LNRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為30.8±3.7條;對照組神經纖維束的數目為19.0±2.2條。經統(tǒng)計學分析，5 nmol/L NRG-1β孵育的標本的神經纖維束的數目與對照組相比P＜0.05，10

9、 nmol/L和20 nmol/L NRG-1β孵育的標本的神經纖維束的數目與對照組相比P＜0.001。5 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為39.6±5.0個;10 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為54.6±6.7個;20 nmol/LNRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為62.2±5.7個;對照組神經元遷出的數目為31.6±4.0個。經統(tǒng)計學分析，5nmol/L NRG-1β孵育的標

10、本神經元遷出的數目與對照組相比P＜0.05，10 nmol/L和20 nmol/L NRG-1β孵育的標本神經元遷出的數目與對照組相比P＜0.001。這些結果表明，NRG-1β可促進體外培養(yǎng)的DRG神經節(jié)組織塊神經突起的生長和神經節(jié)組織塊內神經元向周圍的遷移并呈劑量依賴性。
　　 第三部分神經調節(jié)蛋白-1β對二硫化碳毒性的背根神經節(jié)神經元的保護作用
　　 為了檢測NRG-1β是否會對具有CS2毒性的DRG神經元的生長和遷

11、移具有保護作用以及NRG-1β發(fā)生作用機制，器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1) CS2組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2孵育;
　　 (2) CS2+NRG-1β組: DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (3) CS2+LY294002+NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+10μmol/L LY294002

12、+20 nmol/LNRG-1β孵育，其中LY294002在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (4) CS2+PD98059+ NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+10μ mol/L PD98059+20 nmol/LNRG-1β孵育，其中PD98059在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (5)CS2+LY294002+ PD98059+NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 m

13、mol/L CS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育，其中LY294002和PD98059在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (6)對照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內孵育作為對照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測神經元突起的生長，用NF-200進行免疫熒光標記，檢測DRG神經元的遷移。結果顯示，經定量計數神經纖維束的數目為:

14、r>　　 (1)0.1 mmol/L CS2孵育的標本，神經纖維束的數目為11.5±1.5條;
　　 (2)0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為19.2±1.7條;
　　 (3)0.1 mmol/L CS2+10 mol/L LY294002+20 nmol/LNRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為17.0±1.2條:
　　 (4)0.1 mmol/L

15、 CS2+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為15.8±1.2條;
　　 (5)0.1mmol/L CS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經纖維束的數目為15.5±1.4條;對照組神經纖維束的數目為19.7±1.3條。
　　 經定量計數神經元遷移的數目為:
　　 (1)

16、0.1 mmol/L CS2孵育的標本，神經元遷出的數目為19.9±2.9個;
　　 (2)0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為33.3±4.1個;
　　 (3)0.1 mmol/L CS2+10μmol/L LY294002+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為27.5±3.2個;
　　 (4)0.1 mmol/L CS2+10μ

17、mol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為28.5±2.8個;
　　 (5)0.1 mmol/LCS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標本，神經元遷出的數目為24.3±2.9個;對照組神經元遷出的數目為34.8±4.6個。
　　 經統(tǒng)計學分析，0.1 mmol/L CS2孵育使神經纖維束和神經元遷

18、出的數目與對照組相比減少，20 nmol/L NRG-1β恢復由CS2引起的神經纖維束和神經元遷出數目的減少，單獨應用LY294002或PD98059或者同時應用LY294002和PD98059可部分阻斷NRG-1β的作用。以上結果表明，NRG-1β對具有CS2毒性的DRG神經元突起的生長和神經元的遷移有一定的保護作用，磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt和細胞外信號調節(jié)