HCN通道對小鼠腸道傳入神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、消化道外來感覺神經(jīng)分為迷走傳入和脊髓傳入兩部分，其胞體分別位于顱底結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(nodose ganglia，NG)和脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)。兩者不僅起源不同，其功能上也有顯著差異。迷走傳入神經(jīng)對胃和小腸的低強(qiáng)度機(jī)械刺激敏感，是低閾值機(jī)械感受器；脊髓傳入神經(jīng)含有高閾值和廣泛動力機(jī)械感受器。腸道高敏感性疾病如腸易激綜合癥，是常見的慢性胃腸功能紊亂性疾病，表現(xiàn)為腹痛、腹脹、排便習(xí)慣改變及大便性狀異常等

2、癥狀，這些癥狀可能與迷走和脊髓傳入神經(jīng)敏感性的改變有關(guān)。因此，小腸迷走和脊髓初級傳入神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在內(nèi)臟高敏感性疾病過程中所起的作用正受到越來越多的重視。
　　 在哺乳動物中，介導(dǎo)Ih電流的超極化激活環(huán)核苷酸門控的陽離子通道(Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)家族有4個亞型即HCN1～HCN4，可組成同聚體或異聚體通道。不同亞

3、型構(gòu)成的HCN通道在通道動力學(xué)和藥理學(xué)特征方面存在差異。在表達(dá)有HCN通道的細(xì)胞，膜電位的超級化可激活該通道，誘發(fā)一內(nèi)向電流，使膜電位朝去極化方向改變。本研究目的是確定HCN通道對正常和內(nèi)臟高敏感小鼠空腸初級傳入神經(jīng)機(jī)械敏感性的調(diào)控作用。
　　 1.HCN通道對小鼠腸道傳入神經(jīng)機(jī)械敏感性的調(diào)節(jié)作用：我們在正常小鼠離體空腸標(biāo)本記錄傳入神經(jīng)活動，觀察HCN通道拮抗劑對腸道傳入神經(jīng)機(jī)械敏感性的影響。在漸增性壓力充脹空腸期間，傳入神經(jīng)活

4、動隨腸內(nèi)壓的逐步升高呈雙相增加，這是由于低閾值、廣泛動力機(jī)械感受器和高閾值傳入神經(jīng)纖維的依次激活引起的。HCN通道阻斷劑CsCl(5 mmol/L)和ZD.7288(10μmol/L)都抑制低閾值腸道傳入神經(jīng)活動，而對高閾值傳入神經(jīng)活動沒有明顯影響。這些結(jié)果提示，低閾值的迷走傳入神經(jīng)可能表達(dá)功能性HCN通道，對其興奮性具有增強(qiáng)作用；而在正常情況下，高閾值的脊髓傳入神經(jīng)的興奮性并不受HCN通道的調(diào)節(jié)。
　　 2.HCN通道在腸道迷

5、走和脊髓傳入神經(jīng)元的表達(dá)與功能：為明確HCN通道對腸道迷走和脊髓傳入神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)作用，我們采用膜片鉗和免疫組織化學(xué)方法，在迷走和脊髓傳入神經(jīng)元記錄lh電流和檢測HCN1-4亞型的免疫活性。
　　 1)對急性分離培養(yǎng)的小鼠NG和DRG(T7-L2)神經(jīng)元進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗記錄，在電壓鉗模式下檢測超級化電壓誘導(dǎo)的lh電流，在電流鉗模式下檢測超級化電流誘導(dǎo)的膜電位改變。在NG，小(<25μm)、中(25-35μm)和大(>35μm

6、)細(xì)胞分別有36％(10/28)、56％(30/54)和100％(1/1)表達(dá)Ih電流；在DRG，也分別有23％(9/39)、70％(61/87)和100％(14/14)的小、中和大細(xì)胞表達(dá)lh電流。大神經(jīng)元上lh的幅度大于中小神經(jīng)元，-120 mV時電流峰值分別為DRG：-60.51±13.60 pA，-139.00±14.81 pA，-318.77±62.59 pA；NG：-78.18±18.88 pA，-81.96±14.80 p

7、A，-170.69 pA，但各直徑組lh的激活曲線無明顯差別。lh可被CsCl(5 mmol/L)完全阻斷。在電流鉗模式下，超級化電流刺激時，膜電位發(fā)生瞬時超級化后隨即去極化，呈現(xiàn)出“袋狀”(sag)的膜電位變化，這種繼發(fā)性去極化也可被CsCl完全阻斷。這些結(jié)果證實，部分迷走和脊髓初級傳入神經(jīng)元表達(dá)有功能性HCN通道，HCN通道激活可使這些神經(jīng)元的興奮性提高。
　　 2)為明確HCN通道在腸道的脊髓和迷走初級傳入神經(jīng)元上的表達(dá)與

8、功能，我們向小鼠空腸壁微量注射熒光指示劑Dil逆行以標(biāo)記支配腸道的DRG和NG神經(jīng)元，并對Dil陽性細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。在71.4％(20/28)的Dil陽性DRG神經(jīng)元和90.9％(10/11)的Dil陽性NG神經(jīng)元上都記錄到超級化激活的、可被胞外CsCl阻斷的內(nèi)向電流(lh)。由于HCN1-4對cAMP的敏感性不同，我們觀察了8-Br-cAMP(可透膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi))對Dil陽性NG和DRG細(xì)胞lh電流的影響，發(fā)現(xiàn)8-Br-cAM

9、P可促進(jìn)部分(3/11)DRG神經(jīng)元lh電流的激活，而對NG神經(jīng)元的lh電流沒有明顯影響。這些結(jié)果不僅證實小腸傳入神經(jīng)元大都表達(dá)功能性HCN通道，而且提示小腸的迷走和脊髓傳入神經(jīng)元可能表達(dá)不同的HCN亞型。
　　 3)采用免疫熒光法檢測了DRG和NG中HCN1-4免疫活性。在未做腸道逆行標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)標(biāo)本，DRG和NG切片中都未檢測到HCN1免疫活性；在DRG內(nèi)，12.3％神經(jīng)元和大量神經(jīng)纖維高表達(dá)HCN2，但在NG內(nèi)僅有2.3％

10、神經(jīng)元和少量神經(jīng)纖維表達(dá)HCN2；DRG內(nèi)部分神經(jīng)元弱表達(dá)HCN3，但NG內(nèi)多數(shù)神經(jīng)元有相對較強(qiáng)的HCN3免疫染色；DRG內(nèi)偶見HCN4陽性的神經(jīng)元，但NG內(nèi)未檢測到HCN4免疫活性。在取自腸壁注射了Dil的小鼠的神經(jīng)節(jié)，可見部分Dil陽性DRG神經(jīng)元高表達(dá)HCN2和弱表達(dá)HCN3，而Dil陽性NG神經(jīng)元具有相對較強(qiáng)的HCN3染色。這些結(jié)果表明，在正常動物，支配小腸的迷走初級傳入神經(jīng)元主要表達(dá)HCN3，而脊髓初級傳入神經(jīng)元主要表達(dá)HCN

11、2。
　　 3.HCN通道在外周性內(nèi)臟高敏感中的作用：采用空腸腔內(nèi)注射TNBS(TNBS：50mg/kg，30％乙醇1.5 ml/kg)的方法建立腸道高敏感模型，在建模后7、14、21和56天，離體腸管實驗測定空腸傳入神經(jīng)對充脹刺激的反應(yīng)，觀察HCN阻斷劑對傳入神經(jīng)機(jī)械敏感性的影響，并采用免疫組化方法檢測DRG和NG內(nèi)HCN1-4免疫活性，從而分析HCN通道在外周性內(nèi)臟高敏感中的作用。初步結(jié)果顯示：
　　 1)與對照組相

12、比，TNBS處理后7-56d，空腸傳入神經(jīng)的低閾值放電活動沒有明顯改變，但高閾值放電活動明顯增加。在TNBS處理后7d組，CsCl(5mmol/L)對低閾值和高閾值放電活動皆沒有明顯影響；TNBS處理后14d組，CsCl抑制低閾值放電活動，但增強(qiáng)高閾值放電活動；TNBS處理后21d組，CsCl抑制低閾值放電，對高閾值放電無明顯影響；TNBS處理后56d組，CsCl對低閾值和高閾值放電皆無明顯影響。
　　 2)與對照組相比，TNB

13、S處理后7-56d，NG和DRG內(nèi)HCN2免疫活性呈逐步增加的趨勢，其中14d組NG內(nèi)及21d組DRG內(nèi)的HCN2陽性細(xì)胞計數(shù)顯著增加(14d-NG：8.76％vs2.33％，P<0.05；21d-DRG：30％vs12.3％，P<0.05)，但NG和DRG內(nèi)HCN3的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。
　　 綜上所述，本研究在細(xì)胞及器官水平探討了HCN通道在小腸傳入神經(jīng)上的表達(dá)及對傳入神經(jīng)機(jī)械敏感性的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果較清楚地表明：支配小