超極化激活環(huán)核苷酸門控(HCN)通道及其亞型在大鼠膀胱興奮性調(diào)控中的作用初探.pdf

1、背景與研究目的：
　　 膀胱興奮性的改變在多種排尿功能障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。而導致膀胱興奮性變化的原因很多，如梗阻、炎癥、神經(jīng)病變等，其中以膀胱部分出口梗阻(partial bladder outlet obstruction，PBOO)和其他中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)病變多見，是導致尿頻、尿急、甚至急迫性尿失禁等膀胱過度活動(overactive bladder，OAB)癥候群的重要原因。目前對OAB的發(fā)病機制尚未

2、完全闡明，臨床針對其治療主要還是以膽堿能神經(jīng)受體作為主要靶點，輔助應用腎上腺素能受體阻斷劑及鈣離子通道阻斷劑配合治療。面對部分由非神經(jīng)因素造成的特發(fā)性OAB患者，該治療效果欠佳。毫無疑問，對膀胱興奮性的研究成為當前領域的研究熱點。
　　 膀胱主要受神經(jīng)系統(tǒng)的支配，同時，也具有不依賴神經(jīng)因素的自發(fā)性興奮性。對各種病理狀態(tài)下的膀胱興奮性改變的認識，目前學術(shù)界存在著兩派學說，即以WC deGroat為代表“神經(jīng)源性學說”和以AF Br

3、ading為代表的“肌源性學說”。前者長期以來強調(diào)，膀胱的活動是由中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)控制的，其發(fā)生的一系列興奮性及收縮性的改變均與神經(jīng)有著密切聯(lián)系，主要表現(xiàn)在傳入傳出神經(jīng)或神經(jīng)元的變化、各種神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和分泌變化以及各種神經(jīng)受體數(shù)量和功能的變化。但后者認為，除開神經(jīng)的影響因素，逼尿肌本身興奮性的變化、逼尿肌細胞之間通訊的改變、各種化學和牽張感受細胞的生理功能變化也參與了膀胱興奮性的調(diào)控。目前，“肌源性”學說作為傳統(tǒng)“神經(jīng)源性”學說的重

4、要補充已逐步被學術(shù)界認可，在膀胱興奮性調(diào)控領域的影響日漸增加。
　　 膀胱卡哈爾間質(zhì)細胞(interstitial cell of Cajal，ICC)的發(fā)現(xiàn)，使膀胱來源的因素在膀胱興奮性調(diào)控中的作用逐漸受到重視。膀胱ICCs是2002年首先被英國學者McCloskey在豚鼠中發(fā)現(xiàn)的一類與胃腸道起搏細胞ICC類似的特殊間質(zhì)細胞。膀胱ICCs的具體生理作用目前還有爭議，從最初的參與膀胱活動的起搏，到神經(jīng)信號的整合及傳遞，以及作為感

5、受器將各種刺激上傳，都進行了深入的研究。而離子通道，這種參與細胞興奮性調(diào)控最直接的組件，在膀胱中，尤其是膀胱平滑肌(bladder smoothmuscle cells，BSMCs)和ICCs上，被作為中心環(huán)節(jié)進行了諸多研究，也是目前膀胱興奮性的研究熱點。
　　 膀胱ICCs維持其功能及發(fā)揮作用依賴于細胞膜及胞內(nèi)分布的各種離子通道。目前在膀胱ICCs上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的通道非常多，與細胞興奮性和收縮性直接相關(guān)的包括電壓門控鈣通道、大電導

6、鈣激活鉀通道、ATP依賴的鉀通道、快速激活的鈉通道、氯離子通道等。而在自發(fā)節(jié)律產(chǎn)生中占有絕對關(guān)鍵地位的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN)通道在可興奮細胞中的研究才剛剛起步，只是在神經(jīng)元及竇房結(jié)中得到了深入探討，而其他組織中的各種重要可興奮細胞上的研究還只停留在初級階段。HCN通道對于細胞興奮性的維持和調(diào)節(jié)可能具有重要且深遠的意義。

7、
　　 HCN通道是最初在心臟和神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的一類具有特殊生理特性的離子通道，他和其他眾多在去極化階段激活的通道相反，在超極化階段才能激活，并引發(fā)陽離子內(nèi)流，HCN通道具有普通離子通道不具備的一些特殊的特性，比如復雜的雙門控調(diào)節(jié)、混合離子通透性、微弱的單通道電導等，而其產(chǎn)生的Ih電流呈電壓依賴性，除了被普遍認為是起搏活動必須的“起搏電流”外，還具有穩(wěn)定細胞膜電位、參與可興奮細胞自律性的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與各種感覺、視覺、

8、聽覺信號整合等基礎生理功能。HCN通道是否在胃腸道ICCs中參與其慢波電位的形成也是學者們最為關(guān)注的方面，在竇房結(jié)以外的細胞和組織中，HCN通道產(chǎn)生的Ih電流能否成為pacemaker的主要構(gòu)成成分都是亟待解決的問題。
　　 膀胱興奮性改變在膀胱病理狀態(tài)下導致的一系列臨床癥狀有直接的聯(lián)系，膀胱ICCs作為新近發(fā)現(xiàn)的一類特殊間質(zhì)細胞，在泌尿系統(tǒng)中具有多種生理功能，且與膀胱興奮性調(diào)控密切相關(guān)。而同樣參與多種生理功能調(diào)控的HCN通道及

9、其亞型是否參與膀胱興奮性調(diào)控是一個非常有趣而且大膽的設想，目前世界上還沒有針對這個方面進行研究的團隊。首次將膀胱ICCs上的HCN通道作為膀胱興奮性研究的切入點具有一定的前瞻性，可為膀胱興奮性調(diào)控研究提供新的思路，并為臨床治療排尿功能障礙性疾病提供了潛在的作用靶點，豐富泌尿系統(tǒng)病理生理的理論基礎。
　　 基于膀胱興奮性的調(diào)節(jié)，本研究通過分子生物學和形態(tài)學方法對HCN通道及其亞型在膀胱ICCs中的表達及分布進行觀察，通過功能學手段

10、對HCN通道參與ICCs興奮性調(diào)控和膀胱興奮收縮的機制進行了初步探索，并對膀胱ICCs上的HCN通道的基本生理特性進行了初步研究。
　　 材料及方法：
　　 本研究采用2-3月齡大鼠作為主要研究對象，首先利用RT-PCR和Western blotting技術(shù)對正常膀胱組織中HCN通道1-4四個亞型的表達進行研究；然后通過免疫熒光技術(shù)闡述該通道四個亞型在膀胱中的具體分布情況；通過金屬離子熒光探針負載技術(shù)觀察培養(yǎng)的ICCs胞

11、內(nèi)鈣離子和鉀離子濃度在HCN通道阻斷劑作用下的變換，以及對該通道阻斷劑對離體膀胱逼尿肌肌條牽張誘發(fā)的節(jié)律性收縮的影響，從而了解該通道在膀胱興奮收縮中的作用；最后利用膜片鉗技術(shù)對急性分離的ICCs上的HCN通道電流進行檢測，并記錄特異性阻斷劑下該電流的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR發(fā)現(xiàn)膀胱組織中HCN1-4四個亞型的mRNA均有表達，與心臟和小腸類似；WB檢測發(fā)現(xiàn)膀胱組織中HCN1-4四個亞型的蛋白均有表

12、達，利用灰度值進行半定量分析發(fā)現(xiàn)HCN1亞型表達比例最高。
　　 2.激光共聚焦顯微鏡觀察正常大鼠膀胱中HCN陽性和c-kit陽性的細胞有共存現(xiàn)象，與myosin陽性的細胞無共存現(xiàn)象。
　　 3.膀胱ICCs中表達的HCN亞型以HCN1、HCN2、HCN4為主，并未檢測到HCN3亞型表達。
　　 4.HCN通道阻斷劑ZD7288能使靜息狀態(tài)下的膀胱ICCs胞內(nèi)鈣一過性不明顯上升，但能顯著降低高鉀誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃

13、度升高。
　　 5.ZD7288能顯著降低靜息狀態(tài)下的膀胱ICCs胞內(nèi)鉀離子濃度，但拮抗高鉀誘發(fā)的胞內(nèi)鉀離子濃度上升效果不明顯。
　　 6.ZD7288可顯著降低正常逼尿肌肌條的自發(fā)性收縮幅度，但小幅度上調(diào)了收縮頻率，且ICCs特異性拮抗劑Glivec作用后收縮現(xiàn)象無明顯變化。
　　 7.成功獲得急性酶分離的大鼠膀胱ICCs，并在該細胞上記錄到典型的Ih電流軌跡，ZD7288作用10min后效果穩(wěn)定，能顯著降低該

14、電流強度。
　　 結(jié)論：
　　 1.正常大鼠膀胱中HCN通道主要表達在膀胱ICCs上，亞型以HCN1、HCN2、HCN4為主，未發(fā)現(xiàn)HCN3亞型表達。而平滑肌上則沒有HCN通道表達。
　　 2.HCN通道與膀胱ICCs的興奮密切相關(guān)，阻斷該通道能降低興奮時胞內(nèi)的鈣離子濃度。且該通道參與了穩(wěn)定膀胱ICCs靜息狀態(tài)下膜電位的作用，ICCs興奮時該通道阻斷劑使胞內(nèi)鉀離子濃度下降不明顯說明細胞K+內(nèi)流并不是主要依靠HCN