成年豚鼠膀胱ICC上超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道(HCN)電生理的初步研究.pdf

1、眾所周知，膀胱肌組織能夠產(chǎn)生不受神經(jīng)系統(tǒng)控制的白發(fā)性動(dòng)作電位，但目前其機(jī)制尚未明了。前期的研究中已經(jīng)證實(shí)了膀胱存在ICC，簡(jiǎn)單記錄了Ih電流。這些結(jié)果都不能證實(shí)ICC在膀胱中到底起到何種作用。 Ih電流(在心臟稱(chēng)為If電流)在胃腸道和心臟竇房結(jié)的研究中被認(rèn)為是“起搏電流”，而HCN通道是Ih電流的分子基礎(chǔ)。我們前期的系列研究中已經(jīng)提示ICC上可能存在HCN通道，但是其電生理特征還尚未明確。同時(shí)，既往的實(shí)驗(yàn)方法中采用培養(yǎng)的ICC

2、進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)，效果并不理想，其主要原因是培養(yǎng)后的ICC進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)時(shí)難度很大，而且其所測(cè)參數(shù)并不一定代表了真實(shí)生理狀態(tài)下的情況。 因此本實(shí)驗(yàn)的目的：建立一套穩(wěn)定、可靠的急性分離方法以獲得活性更好的ICC；觀察ICC上HCN通道的表達(dá)，完善HCN通道基本的電生理參數(shù)，為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論如下： 1.建立了穩(wěn)定可靠的急性分離方法，所得到的細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)是ICC

3、；其酶消化方案為：II型膠原蛋白酶2.0mg/ml，胰酶抑制劑2.0mg/ml，木瓜蛋白酶1.0mg/ml，BSA1.0mg/ml，其消化時(shí)間15min。 2.采用c-Kit和HCN抗原的免疫熒光雙標(biāo)法，證明了c-Kit陽(yáng)性的ICC細(xì)胞上具有HCN通道抗原的陽(yáng)性表達(dá)。 3.ICC上記錄到了Ih電流，其激活電壓位于-140mV～-90mV之間，電流幅度為300-800pA，具有電壓依賴(lài)性，并能被ZD7288(20μM)和C

4、s+(500μM)阻斷。 4.Ih電流反轉(zhuǎn)電位42±2mV，PNa/PK為0.42，膜電容為10-40pF；胞外ZD7288阻斷Ih電流具有濃度依賴(lài)性，其IC50為24.7±6.5μmol/L，且其阻斷效應(yīng)不可逆；胞外Cs+阻斷Ih電流具有濃度依賴(lài)性，其IC50為232.5±24..8μmol/L，且其阻斷效應(yīng)可逆。 5.胞外鈉鉀對(duì)HCN通道皆有影響，具有濃度依賴(lài)性，其濃度的改變會(huì)影響HCN通道的激活和電導(dǎo)；胞外給予TT