HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細胞上的表達和電生理特性研究.pdf

1、背景和目的：
　　膀胱過度活動癥（OAB）是由逼尿肌過度活動（DO）導致的泌尿科常見疾病，臨床表現為尿頻、尿急和緊迫性的尿失禁，如不及時治療，會導致腎盂，輸尿管功能受損并會引起腎積水、最終導致腎功能損害，給患者生活帶來很多不便和沉重的經濟負擔。OAB的發(fā)病機制目前尚未闡明，膀胱逼尿肌興奮性異常是導致的DO的直接原因，研究發(fā)現神經疾病、膀胱出口梗阻和泌尿系統(tǒng)感染等均可引起DO。
　　膀胱逼尿肌興奮性受自主神經和體神經的雙重支配

2、，因此其興奮調控機制較為復雜。目前，神經源性和肌源性兩大學說為最主要的膀胱調控理論。但是，單一的神經源性或者肌源性學說都不能完全解釋膀胱興奮調控機制，例如：神經源性學說不能解釋膀胱離體逼尿肌條自發(fā)性收縮現象，肌源性學說不能解釋膀胱收縮“全/無”的現象，因此，找到這兩大學說關于膀胱興奮調控的功能通路，將有助于深入闡述膀胱的興奮調控和OAB發(fā)病機制。1996年，Smet等人首先發(fā)現在豚鼠和人的膀胱中存在和胃腸道ICC細胞類似的膀胱ICC細胞

3、，其分布于膀胱粘膜下層和平滑肌肌束間。組織結構上，膀胱ICC細胞與神經和逼尿肌細胞間存在緊密的聯系。同時證實粘膜下ICC細胞與膽堿神經叢緊密相連，并且在ICC細胞上面表達M2、M3膽堿能受體；電鏡顯示ICC細胞與膀胱逼尿肌細胞之間存在緊密的縫隙連接；這些都說明膀胱ICC細胞在膀胱興奮調控中的樞紐作用。其發(fā)現為我們找到神經源性/肌源性這兩大學說關于膀胱興奮調控機制的共同通路提供了可能，研究膀胱ICC細胞的興奮傳導和調控機理，會有助于我們深

4、入了解膀胱的興奮調控及OAB發(fā)病機理，為OAB的治療提供新的理論基礎和靶點。
　　HCN(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide cation channel,HCN)通道是超極化激活環(huán)核苷酸門控的陽離子通道，其由6個跨膜片段(S1-S6)組成，位于 S5和S6間的一段氨基酸序列部分形成K+離子選擇性通道所特有的GYG標志序列。HCN通道所介導的Ih電流被認為是起搏細胞的重要特征

5、，在包括心臟和大腦起搏活性的生理功能上發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現膀胱ICC細胞表達HCN1-4通道亞型，可產生HCN通道內向超極化電流Ih。HCN通道阻滯劑ZD7288可降低膀胱ICC細胞內T型鈣通道電流，并可顯著降低膀胱逼尿肌收縮頻率和幅度。這說明 HCN通道可調控鈣離子軸影響膀胱ICC細胞興奮。因此HCN通道源性的ICC細胞興奮調節(jié)在膀胱興奮調控中發(fā)揮重要作用。在許多疾病狀態(tài)下，HCN通道的活化和生理特性會發(fā)生變化。研究發(fā)現衰竭心臟的

6、心室肌細胞中HCN通道活化增強。因此我們猜想DO可能與膀胱ICC細胞HCN通道的變化有關。研究DO膀胱ICC細胞中HCN通道的表達和電生理變化有利于闡明DO的發(fā)病機制，并為治療DO提供新的靶點。
　　而DO的發(fā)病原因以PBOO性疾病最為多見，其中以BPH最為多見。大量的研究表明，膀胱出口梗阻后膀胱ICC細胞數量和生理功能的改變在PBOO所致DO的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。綜上所述，基于HCN源性的ICC細胞興奮在膀胱興奮中的調控作用

7、，本研究擬用PBOO的方法來構建DO大鼠模型，并用假手術組大鼠做正常對照。通過分子生物學和免疫學方法檢測HCN通道各亞型在膀胱ICC細胞中的表達變化，用電生理學方法檢測HCN通道的電生理變化，并探討HCN通道對正常和DO大鼠膀胱的收縮功能影響。
　　方法：
　　第一部分、DO大鼠模型的建立和鑒定
　　通過PBOO的方法來建立DO大鼠模型，行下腹部正中切口，對大鼠膀胱出口處進行結扎模擬膀胱出口部分梗阻，術后縫合下腹部。假

8、手術組大鼠只進行切開并縫合，不做下尿道接扎。手術完成后8周行膀胱充盈性測壓實驗，觀察大鼠膀胱的排尿收縮是否正常。對于手術組大鼠，如果膀胱充盈性測壓實驗顯示非正常的膀胱排尿收縮記為DO模型大鼠；假手術組大鼠則記為正常對照組。
　　第二部分、HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細胞中的表達變化
　　1．取正常對照組和DO模型組大鼠膀胱，用RT-PCR的方法檢測HCN1-4通道亞型mRNA在DO膀胱ICC細胞上的表達變化；
　　2

9、．取正常對照組和DO模型組大鼠膀胱，用WB的方法檢測HCN1-4通道亞型蛋白在DO膀胱ICC細胞上的表達變化；
　　3.取正常對照組和DO模型組大鼠膀胱，用免疫熒光雙標染色的方法檢測HCN1-4通道亞型在DO膀胱ICC細胞上的表達變化。
　　第三部分、HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細胞中的電生理變化及對膀胱收縮功能影響
　　1．分離得到正常對照組和DO模型組大鼠膀胱ICC細胞，用膜片鉗的方法檢測HCN通道電流Ih的密度

10、和激活電壓變化情況；
　　2．分離得到正常對照組和DO模型組大鼠膀胱ICC細胞，用活細胞工作站的方法檢測HCN通道特異性阻滯劑ZD7288對兩組ICC細胞內鈣離子濃度的影響；
　　3．取正常對照組和DO模型組大鼠膀胱進行肌條實驗，觀察HCN通道特異性阻滯劑ZD7288對兩組膀胱逼尿肌收縮功能的影響。
　　結果：
　　第一部分、DO模型大鼠的建立和鑒定
　　膀胱充盈性測壓實驗顯示DO組大鼠膀胱的排尿反射不是呈

11、現充盈-排尿-充盈的膀胱排尿反射，而是出現非自主的過度活動的膀胱排尿反射。證明PBOO手術成功構建DO大鼠模型。
　　第二部分、HCN通道在DO模型大鼠膀胱ICC細胞中的表達變化
　　1．RT-PCR的結果顯示HCN1-4通道亞型mRNA在DO大鼠膀胱ICC細胞上的表達相對于對照組有明顯增加；
　　2．WB的結果顯示HCN1-4通道亞型蛋白在DO大鼠膀胱ICC細胞上的表達相對于對照組有明顯增加；
　　3.免疫熒光

12、雙標的結果顯示HCN1-4通道亞型蛋白在DO大鼠膀胱ICC細胞上的表達相對于對照組有明顯增加。
　　第三部分、HCN通道在DO模型大鼠膀胱ICC細胞中的電生理變化及對膀胱收縮功能影響
　　1．膜片鉗的結果顯示DO大鼠膀胱ICC細胞上Ih電流密度相比于對照組ICC細胞明顯增加，并且Ih電流的的最大半激活電壓V1/2也明顯降低；
　　2．活細胞工作站的結果顯示10μmol/L的ZD7288可以明顯抑制對照組ICC細胞內鈣離

13、子濃度，而同樣10μmol/L的ZD7288卻不能抑制DO組ICC細胞內鈣離子濃度。當ZD7288的濃度上升到50μmol/L時，對照和正常組ICC細胞內的鈣離子濃度都會受到明顯抑制；
　　3．膀胱逼尿肌條實驗的結果顯示10μmol/L的ZD7288可以明顯抑制對照組逼尿肌條的收縮幅度，而同樣10μmol/L的ZD7288卻不能抑制DO組膀胱逼尿肌條的收縮幅度。當ZD7288的濃度上升到50μmol/L時，DO模型組和正常對照組逼

14、尿肌條的收縮幅度都會受到明顯抑制。
　　結論：本課題探索HCN通道在DO模型大鼠膀胱ICC細胞上的表達和電生理性質變化：
　　一、在PBOO所致DO模型大鼠膀胱ICC細胞中HCN通道m(xù)RNA和蛋白的表達量較正常對照組有明顯升高。
　　二、DO模型大鼠膀胱ICC細胞中Ih電流密度升高，并且隨著HCN通道的表達量升高會造成膀胱ICC細胞內的鈣離子信號和膀胱收縮功能的增強。結果提示HCN通道可能參與DO的發(fā)病，為臨床DO的診