膀胱ICC細胞在神經(jīng)源性膀胱興奮性改變中的作用探討.pdf

1、背景及目的:探討膀胱Cajal間質(zhì)細胞(Interstitial cell of Cajal，ICC)在神經(jīng)源性膀胱興奮性改變中的作用。神經(jīng)源性膀胱(Neurogenic bladder，NGB)是臨床上常見的一種膀胱功能障礙，脊髓損傷是其常見原因之一。主要有兩種類型：骶髓損傷(Sacral cord injury，SCI)和骶髓上損傷(Suprasacral cord injury，sscD，骶髓損傷會導(dǎo)致逼尿肌無反射(Detruso

2、rareflexia，DA)，表現(xiàn)為排尿期膀胱不能收縮或者收縮無力；而骶髓上損傷會導(dǎo)致逼尿肌反射亢進(Detrusor hyperreflexia，DH)，表現(xiàn)為儲尿期出現(xiàn)膀胱自發(fā)或誘發(fā)的收縮。既往對神經(jīng)源性膀胱發(fā)病機理的研究多進行的是神經(jīng)病理學(xué)研究，傳統(tǒng)理論認(rèn)為，骶髓損傷的部位在骶髓初級排尿中樞，膀胱失去初級排尿中樞的控制，表現(xiàn)為排尿期不能出現(xiàn)收縮；骶髓上損傷的部位為骶髓以上，骶髓初級排尿中樞保存完整，失去高位中樞的控制，膀胱出現(xiàn)反射

3、亢進的表現(xiàn)。但這些理論對神經(jīng)病變后逼尿肌水平何種病變的下游機制解釋不清，進一步的研究也發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)源性膀胱的膀胱壁也出現(xiàn)一系列的病理改變，包括肌細胞排列紊亂，分布不均勻；肌細胞間隙增寬或不均勻，彈性纖維減少，膠原纖維增生；中間連接減少，伴有縫隙連接的出現(xiàn)等等，但兩種不同的病變都有類似的病理改變，顯然還有我們未知的病理生理改變導(dǎo)致了膀胱功能的繼發(fā)性改變。 Cajal間質(zhì)細胞是胃腸道平滑肌活動的起搏細胞，參與胃腸道基本電節(jié)律(Bas

4、icelectrical rhythm，BER)的產(chǎn)生、傳遞電信號以及介導(dǎo)腸神經(jīng)和平滑肌之間的信號調(diào)節(jié)。ICC細胞保持正常的結(jié)構(gòu)、功能及分布，對胃腸動力的產(chǎn)生和功能調(diào)控至關(guān)重要，其分布密度的異常和細胞網(wǎng)絡(luò)完整性破壞與一些胃腸動力紊亂性疾病如Hirschsprung's病和慢性傳輸型便秘的發(fā)生密切相關(guān)。近年來國內(nèi)外學(xué)者用相差顯微鏡、免疫組織化學(xué)分析和電鏡技術(shù)研究人或動物具有自發(fā)性活動的平滑肌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，ICC細胞普遍存在于各種器官，包括泌尿

5、道的腎盂、輸尿管和膀胱，但ICC細胞在泌尿道的作用還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)泌尿道存在ICC細胞，且具有自發(fā)性興奮的特征。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在先天性腎盂輸尿管連接部梗阻患者，腎盂輸尿管連接部ICC細胞數(shù)量減少；在先天性巨結(jié)腸-巨膀胱-小腸蠕動失遲緩癥患者，膀胱ICC細胞數(shù)量也是減少的；在人膀胱出口梗阻引起的過度活動膀胱中ICC細胞數(shù)量增加；本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，在大鼠膀胱出口梗阻引起的逼尿肌不穩(wěn)定模型中，膀胱ICC細胞數(shù)量也明顯增加，這些都提

6、示ICC細胞可能在膀胱活動中起重要作用。因此，我們推測不同部位脊髓損傷后膀胱功能出現(xiàn)了典型的逼尿肌反射亢進和逼尿肌無反射表現(xiàn)，是否與ICC細胞的變化有關(guān)？ ICC細胞特異性表達c-kit受體(Kit是一種編碼酪氨酸激酶受體的原癌基因)，Kit信號通路對細胞的發(fā)育和表型維持至關(guān)重要。甲磺酸伊馬替尼(Glivec)是一個選擇性的c-kit受體酪氨酸激酶抑制劑，經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于治療費城染色體陽性的慢性髓樣白血病和c-kit陽性的

7、胃腸道間質(zhì)腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)Glivec不僅可以抑制胃腸道ICC細胞的表達，還可以抑制離體豚鼠膀胱自發(fā)性活動和逼尿肌的自發(fā)性動作電位，說明ICC細胞可能參與了膀胱的自發(fā)性活動和逼尿肌的自發(fā)性動作電位。 本課題擬通過對比研究骶髓上及骶髓損傷后逼尿肌反射亢進和逼尿肌無反射膀胱ICC細胞數(shù)量變化、興奮性變化及用Glivec阻斷從細胞水平、組織水平和在體水平阻斷ICC后，觀察ICC細胞興奮性變化、肌條自發(fā)性活動的變化和膀胱功能的改變，探討膀

8、胱ICC細胞在逼尿肌反射亢進和逼尿肌無反射膀胱興奮性改變中的作用。 方法:本課題以成年雌性SD大鼠為研究對象，建立骶髓及骶髓上損傷實驗?zāi)Ｐ?，圍繞正常組、膀胱造瘺組、骶髓上損傷組及骶髓損傷組之間的對比進行以下研究：1、形態(tài)學(xué)研究：免疫熒光標(biāo)記各組膀胱ICC細胞，觀察各組膀胱ICC細胞數(shù)量的變化，探討ICC細胞數(shù)量變化與膀胱興奮性改變的可能關(guān)系。2、功能學(xué)研究：急性分離各組膀胱的ICC細胞，激光共聚焦顯微鏡檢測膀胱ICC細胞自發(fā)性鈣

9、波變化、即細胞興奮性的變化，觀察ICC細胞興奮性變化與膀胱興奮性改變的可能關(guān)系。3、甲磺酸伊馬替尼(Glivec)阻斷ICC細胞對膀胱興奮性的影響：①細胞水平：用Glivec阻斷ICC細胞的c-kit受體，觀察阻斷c-kit受體后膀胱ICC細胞興奮性的變化。②組織水平：進行不同組別的膀胱肌條實驗，在實驗過程中加入Glivec，觀察肌條自發(fā)性收縮的變化。③在體水平：進行大鼠膀胱充盈性測壓實驗，經(jīng)尾靜脈注射Glivec，觀察膀胱興奮性改變。

10、 結(jié)果: 1、成功制作了脊髓損傷后逼尿肌反射亢進和逼尿肌無反射兩種動物模型。 2、形態(tài)學(xué)研究顯示：()髓上損傷大鼠膀胱ICC細胞數(shù)量較正常組和膀胱造瘺組明顯增加，膀胱造瘺組和正常組大鼠膀胱ICC細胞無明顯差異，骶髓損傷組膀胱ICC細胞數(shù)量較正常組和膀胱造瘺組減少。 3、成功進行了大鼠膀胱ICC細胞的急性分離和鑒定。 4、功能學(xué)研究顯示：骶髓上損傷大鼠膀胱ICC細胞自發(fā)性興奮性較正常組和膀胱造瘺組明

11、顯增加，膀胱造瘺組大鼠和正常組大鼠膀胱ICC細胞自發(fā)性興奮性無明顯差異，骶髓損傷組膀胱ICC細胞自發(fā)性興奮性較正常組和膀胱造瘺組降低。 5、Glivec可以以劑量依賴性的方式抑制膀胱ICC細胞的自發(fā)性鈣波，低濃度(1×10-6mol/L)的Glivec對逼尿肌反射亢進大鼠膀胱ICC細胞自發(fā)性鈣波有抑制作用，而5×10-5mol/L的Glivec對逼尿肌無反射大鼠膀胱ICC細胞自發(fā)性鈣波有抑制作用。 6、在一定的前負荷(1

12、g)下，各組大鼠膀胱表現(xiàn)了不同的自發(fā)性收縮，逼尿肌反射亢進大鼠膀胱自發(fā)性收縮的幅度高于逼尿肌無反射大鼠膀胱。 7、Glivec可呈劑量依賴性的方式降低膀胱逼尿肌肌條自發(fā)性收縮的幅度，低濃度(1×10-5mol/L)的Glivec對逼尿肌反射亢進大鼠膀胱逼尿肌肌條自發(fā)性收縮的幅度有抑制作用，而5×10-4mol/L的Glivec對逼尿肌無反射大鼠膀胱逼尿肌肌條自發(fā)性有抑制作用。任何濃度的Glivec對肌條自發(fā)性收縮的頻率無影響。

13、 8、10mg/kg的Glivec可以增加逼尿肌反射亢進大鼠膀胱容量和順應(yīng)性，對逼尿肌無反射大鼠膀胱容量和順應(yīng)性無明顯影響。20mg/kg的Glivec抑制逼尿肌反射亢進膀胱充盈過程中的自發(fā)性收縮。 結(jié)論: 1、不同部位脊髓損傷引起的逼尿肌反射亢進和逼尿肌無反射大鼠模型中，膀胱ICC細胞數(shù)量和興奮性出現(xiàn)了不同的變化。 2、Glivec阻斷ICC細胞后，抑制了逼尿肌反射亢進肌條的自發(fā)性收縮，增加了逼尿肌反射亢