細(xì)胞外pH值對(duì)超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、背景:目前心腦血管疾病已成為威脅我國(guó)人民健康和小康建設(shè)的最主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)每年因心血管疾病包括冠心病和腦卒中的死亡人數(shù)約為150萬(wàn)。在心肌梗塞患者發(fā)病時(shí)，其局部的缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致局部較嚴(yán)重的酸中毒，由于血液循環(huán)障礙時(shí)，不利于代謝產(chǎn)物的排出，而且酸中毒時(shí)對(duì)局部組織的影響也非常大，特別是對(duì)冠脈平滑肌和心肌細(xì)胞，因而，在臨床上及時(shí)的糾正酸中毒將極大的減少了對(duì)心梗心肌細(xì)胞的損害。揭示酸中毒對(duì)心肌細(xì)胞損害的機(jī)制，將有助于對(duì)某些心臟疾病的預(yù)后

2、提供理論基礎(chǔ)。在某些疾病導(dǎo)致機(jī)體酸中毒時(shí)，會(huì)改變心肌的竇性心率，心輸出量減少等癥狀。在正常情況下竇房結(jié)是生理起搏點(diǎn)，控制著心臟的跳動(dòng)，竇房結(jié)細(xì)胞自動(dòng)除極頻率決定著心率的快慢。參與竇房結(jié)自動(dòng)除極的離子流目前認(rèn)為有以下幾種:超極化激活的內(nèi)向陽(yáng)離子電流If、持續(xù)性?xún)?nèi)向離子流IST、內(nèi)向鈣電流ICa-T、鈉鈣交換電流INa/Ca、延遲整流性鉀電流Ik、背景電流（包括鈉流和鉀流）、D型ICa-L。超極化激活的環(huán)核苷門(mén)控離子通道（hyperpola

3、rization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN），目前認(rèn)為主要有鈉離子和鉀離子流通過(guò)，近期有研究發(fā)現(xiàn)還有鈣離子流的成分。HCN通道介導(dǎo)的起搏電流引起竇房結(jié)細(xì)胞舒張期去極化，從而在心臟自主搏動(dòng)及心律的調(diào)節(jié)等方面起重要的生理作用。體內(nèi)HCN通道在心臟起博細(xì)胞中呈高表達(dá)，參與心臟起博的產(chǎn)生及心率調(diào)控。有實(shí)驗(yàn)表明，在機(jī)體酸中毒時(shí)，心率是減慢的，但是對(duì)HCN通道的功能變化尚不明確。HC

4、N通道包括四個(gè)亞基，其中心臟中包括3個(gè)亞基(HCN1，HCN2，HCN4)，這三個(gè)亞基在心臟中有可能是同聚體或者是異聚體，為了揭示細(xì)胞外不同PH值對(duì)HCN通道不同亞基的影響，本實(shí)驗(yàn)利用爪蟾卵母細(xì)胞建立表達(dá)HCN通道不同亞基的同聚體及異聚體表達(dá)模型，來(lái)觀(guān)察細(xì)胞外酸性液對(duì)HCN通道不同亞基同聚體或者是異聚體通道電流的影響。
　　目的:建立爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的HCN通道同聚體或者異聚體的細(xì)胞模型，觀(guān)察不同PH酸性液對(duì)HCN通道電流的影響。

5、
　　方法:將HCN1、HCN2的cDNA體外轉(zhuǎn)錄為cRNA后，分別注射至去除濾泡膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，表達(dá)1-3天后使用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄HCN通道電流，非選擇性阻斷劑CsCl可將其完全阻斷，成功建立了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的HCN通道細(xì)胞模型，使用不同PH酸性液觀(guān)察對(duì)HCN通道同聚體及異聚體電流的影響。
　　結(jié)果:在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的HCN1及HCN2通道的同聚體細(xì)胞模型上，記錄到了超極化激活的內(nèi)向陽(yáng)離子電流，可被非選擇性

6、阻斷劑CsC1所阻斷。在1mmol/L的CsCl作用下，HCN通道產(chǎn)生的電流顯著減小，在-140mV水平，HCN1電流值減少率為83.4％±9.5％(n=5，P＜0.001);HCN2產(chǎn)生的電流減少率為99.7％±0.6％(n=4，P＜0.001)。TRIP8b是HCN1的輔助亞基，可使HCN1的電流幅度顯著增大。與HCN1組相比，HCN1的mRNAs稀釋4倍后等比例與輔助亞基TRIP8b注入細(xì)胞后，其電流幅度仍明顯增大，且HCN1+T

7、RIP8b組電流幅度的增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同pH酸性液作用下，HCN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流被抑制，且其電流幅度隨pH值的降低而減小。在-140mV水平，從pH6.5至pH5.0，HCN1電流值減少率為24.6％±8.1％(n=6，P＜0.001);HCN2產(chǎn)生的電流減少率為25.6％±6.8％(n=4，P＜0.01);HCN1+HCN2的電流減少率為21.3％±6.5％(n=4，P＜0.001);在不同pH堿性液作用下，H

8、CN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流幅度改變并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在-140 mV水平，從pH7.5至pH8.0時(shí)， HCN1電流減少率為1.9％±0.1％(n=3，P＞0.05);HCN1+HCN2異聚體電流減少率為5.6％±2.0％(n=3，P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道能夠在爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá);2.在不同pH值的酸性液中HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道電流幅度隨pH值的降低而減小