腸炎后腸系膜傳入神經(jīng)敏感性變化及其機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：正常小鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)化學(xué)以及機(jī)械刺激的敏感性 目的：內(nèi)臟傳入神經(jīng)高敏感與功能性腸病和炎性腸病引起的的臨床癥狀有關(guān)。迷走神經(jīng)和脊神經(jīng)傳入纖維末梢對(duì)腸道局部的機(jī)械和化學(xué)刺激敏感，可以把腸道局部的感覺(jué)信息傳入中樞。在本部分實(shí)驗(yàn)中我們建立離體記錄小鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的實(shí)驗(yàn)裝置，觀察小鼠腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)5-羥色胺、緩激肽以及機(jī)械刺激的放電反應(yīng)，制備腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)5-羥色胺和緩激肽反應(yīng)的劑量

2、效應(yīng)曲線。 方法：C57BL/6小鼠，異氟烷吸入麻醉，腹部正中切口，取一段2厘米長(zhǎng)帶有完整腸系膜的空腸。用特制的由灌流槽和記錄槽兩部分組成的器官浴槽記錄腸系膜傳入神經(jīng)放電。將空腸段放入灌流槽，以克氏液持續(xù)灌流空腸(灌流液溫度32攝氏度，10毫升/分鐘，95％O2/5％CO2混合氣體持續(xù)通氣)?？漳c兩端分別插管固定，插管的頭端通過(guò)三通分別與微量灌流泵和壓力傳感器相連，插管的尾端與大氣相通，由空腸頭端向尾端以10ml/h的速度以克氏

3、液灌流腸腔。經(jīng)過(guò)灌流槽和記錄槽之間的孔隙將腸系膜袢拉入記錄槽固定，在顯微鏡下從腸系膜血管束中仔細(xì)分離腸系膜神經(jīng)，將分離好的神經(jīng)與雙極鉑金電極的其中一個(gè)電極相連，另一個(gè)電極連接直徑與神經(jīng)接近的結(jié)締組織。由電極引導(dǎo)出的神經(jīng)放電信號(hào)和壓力傳感器引導(dǎo)的壓力信號(hào)分別輸入1902單通道放大器，放大后的電信號(hào)以及腸內(nèi)壓信號(hào)均被輸入1401A/D轉(zhuǎn)換器，1401A/D轉(zhuǎn)換器直接與記錄電腦相連，將信號(hào)輸入電腦中的Spike2軟件顯示電信號(hào)和腸蠕動(dòng)信號(hào)，整

4、個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在電腦中持續(xù)記錄，存盤(pán)后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行下線分析(off-lineanaylsis)。 得到穩(wěn)定的基礎(chǔ)放電信號(hào)后，分別觀察器官浴槽中加入5-羥色胺(125μM、250μM，、500μM)、緩激肽(0.25μM、0.5μM、1μM)和機(jī)械壓力刺激(腸內(nèi)壓升高60cmH2O)后腸系膜傳入神經(jīng)放電的改變。對(duì)于同一個(gè)標(biāo)本，只加入一個(gè)濃度劑量的5-羥色胺和緩激肽，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)隨機(jī)選擇二者的濃度直接加入器管浴槽中。，5-羥色胺和緩激

5、肽的在器官浴槽內(nèi)的作用時(shí)間為兩分鐘。升高腸內(nèi)壓時(shí)，將腸腔內(nèi)灌流管的尾端夾閉，而頭端按照原速度持續(xù)灌流，經(jīng)過(guò)大約90秒后腸內(nèi)壓升高60cmH2O。施加刺激的順序?yàn)?-羥色胺、升高腸內(nèi)壓和緩激肽。兩次刺激之間至少有15分鐘的平衡時(shí)間，待神經(jīng)基礎(chǔ)放電穩(wěn)定后再施行下一個(gè)刺激。 根據(jù)動(dòng)作電位的波形和波幅在Spike2軟件的幫助下可以將神經(jīng)放電的信號(hào)與干擾信號(hào)分開(kāi)，分別計(jì)算每秒鐘的最大放電頻率(峰放電頻率)以及刺激作用持續(xù)時(shí)間內(nèi)的平均放電頻

6、率。以施加刺激前兩分鐘的放電頻率為基礎(chǔ)放電頻率，加入5-羥色胺和緩激肽后神經(jīng)放電的改變分別以最大峰放電頻率的增加以及加藥后30秒、1分鐘以及兩分鐘內(nèi)平均放電頻率的增加表示。腸內(nèi)壓升高時(shí)，放電頻率的改變以腸內(nèi)壓每升高10cmH2O時(shí)峰放電頻率和平均放電頻率的增加表示。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組之間行單因素方差分析。 結(jié)論：建立了離體記錄小鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的模型。傳入神經(jīng)放電表現(xiàn)壓力依賴(lài)性的增加。5-羥色胺和緩激肽可以

7、直接作用子傳入神經(jīng)末梢的受體刺激漿膜側(cè)傳入神經(jīng)，放電頻率的增加呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性模式。 第二部分：吲哚美辛誘導(dǎo)腸炎后小鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變及其機(jī)制 目的：有些慢性腸炎病人雖然形態(tài)學(xué)檢查顯示腸粘膜有廣泛的炎性表現(xiàn)，但卻沒(méi)有明顯的腹痛癥狀。在本部分實(shí)驗(yàn)中我們選擇吲哚美辛誘導(dǎo)的炎性腸病模型，觀察腸炎后空腸腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。 方法：C57BL/6小鼠，分別在實(shí)驗(yàn)的第一天和第二天早上8

8、點(diǎn)皮下注射吲哚美辛兩次(60 mg kg-1)誘導(dǎo)腸炎，對(duì)照組接受相同容積的酒精注射。實(shí)驗(yàn)的第三天早上9點(diǎn)，動(dòng)物在異氟烷麻醉狀態(tài)下做腹正中切口，肉眼觀察腸系膜粘附、腸道長(zhǎng)度、腸充血以及潰瘍形成情況，對(duì)炎癥程度行大體評(píng)分。制備空腸石蠟切片，常規(guī)HE染色后鏡下進(jìn)行炎癥評(píng)分。取2厘米長(zhǎng)帶有完整腸系膜的空腸置于器官浴槽中，分離腸系膜神經(jīng)記錄傳入神經(jīng)放電。引導(dǎo)方法與第一部分相同，在記錄腸系膜神經(jīng)放電的同時(shí)觀察腸蠕動(dòng)性的改變。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本至少平衡15分

9、鐘待信號(hào)穩(wěn)定后才正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，施加刺激順序?yàn)?-羥色胺(250μM)、升高腸內(nèi)壓(60cmH2O)和緩激肽(0.5μM)。實(shí)驗(yàn)分為四組，分別記錄施加化學(xué)和機(jī)械刺激后腸系膜傳入神經(jīng)放電的改變(n=6)。1)吲哚美辛注射誘導(dǎo)腸炎組；2)注射酒精的對(duì)照組；3)皮下注射吲哚美辛誘導(dǎo)腸炎，同時(shí)慢性腹腔注射誘導(dǎo)性一氧化氮合酶抑制劑L-N6-(1-iminoethyl)-lysine(L-NIL)(3 mgkg-1，1次/12小時(shí)，注射5次)；4)吲

10、哚美辛誘導(dǎo)腸炎，施加化學(xué)和機(jī)械刺激前10分鐘在浴槽中灌流含有L-NIL(30μM)的克氏液。記錄漿膜側(cè)施加5-羥色胺、緩激肽以及腸內(nèi)壓升高時(shí)傳入神經(jīng)峰放電頻率的增加。施加刺激前兩分鐘的峰放電頻率作為基礎(chǔ)放電頻率。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組數(shù)據(jù)之間用單因素的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(腸蠕動(dòng)和化學(xué)刺激誘導(dǎo)神經(jīng)放電數(shù)據(jù))，不同實(shí)驗(yàn)組腸內(nèi)壓變化引起傳入神經(jīng)放電頻率的增加用雙因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。 結(jié)論：腸炎

11、時(shí)腸系膜傳入神經(jīng)表現(xiàn)出誘導(dǎo)性一氧化氮合酶依賴(lài)性的敏感性下調(diào)，而這種敏感性的下調(diào)看起來(lái)不依賴(lài)于炎癥反應(yīng)本身。提示腸炎時(shí)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶依賴(lài)性的一氧化氮生成可以通過(guò)直接影響傳入神經(jīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)敏感性。 第三部分：DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后結(jié)腸腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變及其機(jī)制 目的：腸炎可以誘導(dǎo)支配腸道的腸外在傳入神經(jīng)的敏感化。本部分的研究中我們利用炎癥性腸病中的大腸炎模型研究腸炎時(shí)結(jié)腸傳入神經(jīng)敏感性的改變及其機(jī)制。我們推

12、測(cè)結(jié)腸炎時(shí)結(jié)腸傳入神經(jīng)的敏感性增加，肥大細(xì)胞和環(huán)加氧酶可能參與了這一過(guò)程。 方法：C57BL/6小鼠以3％右旋糖酐硫酸酯鈉(dextran-sulfate sodium，DSS)代水飲用，連續(xù)飲用7天誘導(dǎo)大腸炎，對(duì)照組正常飲水。第八天將動(dòng)物麻醉，根據(jù)疾病活性指數(shù)對(duì)炎癥進(jìn)行大體評(píng)分(體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值、脾臟重量、糞便連續(xù)性、是否有血便)。切除一段帶有完整腸系膜的近端結(jié)腸用于傳入神經(jīng)放電記錄，與其相毗鄰的一段結(jié)腸制備

13、石蠟切片，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下行組織學(xué)評(píng)分。將行電生理學(xué)記錄的近端結(jié)腸置于器官浴槽中，以克氏液持續(xù)灌流(含有1μM尼莫地平，抑制腸收縮)。腸系膜傳入神經(jīng)的引導(dǎo)方法與第一部分類(lèi)似。待放電信號(hào)穩(wěn)定后，先后施加機(jī)械刺激(腸腔擴(kuò)張)和化學(xué)刺激(0.5μM)，觀察各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物傳入神經(jīng)放電敏感性的改變。對(duì)照組腸段僅用克氏液灌流，來(lái)自大腸炎組的結(jié)腸標(biāo)本分別用克氏液、含有肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑Doxantranzole(10-4 M)或者含有環(huán)加氧酶抑制劑

14、萘普生(10-5M)的克氏液灌流(每組樣本數(shù)均為6)。在Spike2軟件的幫助下，根據(jù)神經(jīng)放電動(dòng)作電位的不同波形和波幅，可以進(jìn)一步對(duì)全神經(jīng)放電信號(hào)進(jìn)行離線分析，分解出單根神經(jīng)纖維，并記錄分離出的所有神經(jīng)纖維的刺激前后總的放電頻率，計(jì)算施加機(jī)械和化學(xué)刺激后各實(shí)驗(yàn)組傳入神經(jīng)最大放電頻率的改變。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組數(shù)據(jù)之間以單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)論：炎癥性腸病的大腸炎模型中，腸系