NRG-1參與大鼠自體神經(jīng)移植再生的機(jī)制研究.pdf

1、雖然顯微外科技術(shù)已經(jīng)有了很大的進(jìn)步和發(fā)展，但是對(duì)于周圍神經(jīng)損傷和再生的病理生理機(jī)制我們?nèi)匀蝗狈ι钊肓私?。周圍神?jīng)缺損的治療仍然是外科醫(yī)生的一個(gè)重大難題。準(zhǔn)確的掌握神經(jīng)損傷修復(fù)的解剖學(xué)、病理生理學(xué)和外科重建技術(shù)是對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)治療的先決條件。對(duì)于大于5cm的神經(jīng)缺失，直接的神經(jīng)吻和會(huì)導(dǎo)致過大的張力，導(dǎo)致治療的失敗，需要進(jìn)行自體神經(jīng)移植或者應(yīng)用套管技術(shù)。對(duì)于套管技術(shù)，雖然在生物醫(yī)學(xué)工程方面取得了很大的創(chuàng)新和突破，但是由于免疫耐受的因素，仍然

2、無法有效的應(yīng)用于臨床治療。自體神經(jīng)移植依然是治療神經(jīng)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是移植后修復(fù)的過程慢，壞死率高，是移植中常常遇到的問題。近年來，許多研究者發(fā)現(xiàn)NRG-1參與了神經(jīng)損傷的修復(fù)，并且發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)的作用。本研究中，為了探索NRG-1在神經(jīng)移植后修復(fù)過程中的調(diào)節(jié)作用，我們采用SD大鼠自體神經(jīng)移植模型，首先觀察了NRG-1的表達(dá)變化及移植神經(jīng)的修復(fù)過程，然后通過反義寡核苷酸技術(shù)，抑制NRG-1在自體神經(jīng)移植模型中的表達(dá)，并采用SB20358

3、0特異性抑制P38α MAPK激活，并分別觀察神經(jīng)移植后髓鞘修復(fù)及神經(jīng)功能恢復(fù)的過程，進(jìn)一步分析NRG-1參與調(diào)控神經(jīng)移植后髓鞘修復(fù)的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　實(shí)驗(yàn)一、NRG-1在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中的變化
　　目的：
　　研究NRG-1在大鼠自體坐骨神經(jīng)移植再生過程中的變化
　　方法：
　　采用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，40只，體重250-300g隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，

4、按手術(shù)后3、7、14、21、28天分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組行坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)自體移植術(shù)，對(duì)照組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合處理，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠足跡的變化，計(jì)算坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI），電生理檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）變化，之后分別切取實(shí)驗(yàn)組移植段坐骨神經(jīng)和對(duì)照組移植對(duì)應(yīng)段的坐骨神經(jīng)，透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化，并通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)II型和III型NRG-1 mRNA的表達(dá)變化，Western blot技術(shù)檢測(cè)NRG-1

5、蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)指數(shù)隨時(shí)間進(jìn)行逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在自體神經(jīng)移植的3-28天實(shí)驗(yàn)組的坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度小于對(duì)照組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均<0.01）；實(shí)驗(yàn)組有髓鞘神經(jīng)纖維的面積（um2）在第7、14、21、28天與對(duì)照組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組軸突直徑在第7、14、21天與對(duì)照組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)差異（P<0.01）；RT-PCR結(jié)果分析顯示，在移植的3-28天II型NRG-1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別<0.01）；Western blot結(jié)果顯示在神經(jīng)移植術(shù)后第3-28天，II型NRG-1和III型NRG-1蛋白表達(dá)也明顯增高，且有顯著性差異（P分別<0.01）。
　　結(jié)論：
　　在神經(jīng)移植后，NRG-1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，II型NRG-1和III型NRG-1表達(dá)改變不同。NR

7、G-1可能參與了神經(jīng)移植后髓鞘再生的調(diào)節(jié)過程。
　　實(shí)驗(yàn)二、II型NRG-1在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中的作用
　　目的：
　　研究II型NRG-1在大鼠自體坐骨神經(jīng)移植再生過程中可能的作用。
　　方法：
　　采用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，54只，體重250-300g隨機(jī)分為空白組（Blank）、緩沖液對(duì)照組（Model）和反義寡核苷酸抑制組（ASON），每組18只，按手術(shù)后3、7、14、21、28、35天分

8、為6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。緩沖液對(duì)照組和反義寡核苷酸抑制組行自體坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)移植術(shù)，在術(shù)后當(dāng)日和第三天，Model組給予手術(shù)切口局部注射PBS緩沖液，ASON組給予注射II型NRG-1反義寡核苷酸；空白組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合處理。在不同時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠足跡的變化，計(jì)算坐骨神經(jīng)指數(shù)，電生理檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。之后分別切取Model組及ASON組移植段坐骨神經(jīng)和Blank組移植對(duì)應(yīng)段的坐骨神經(jīng)，透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化，RT-PCR技

9、術(shù)檢測(cè) II型NRG-1 mRNA的變化，以及通過Western blot技術(shù)檢測(cè)II型NRG-1蛋白變化，分析II型NRG-1在自體神經(jīng)移植中可能的作用。
　　結(jié)果：
　　發(fā)現(xiàn)術(shù)后ASON組除第3天以外，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ASON組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于Model組的結(jié)果且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在移植的14-35天，抑制II型NRG-1的表達(dá)，可減慢大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。說明缺少II型NRG-1減緩自體移植神經(jīng)的再生

10、。髓鞘的形態(tài)學(xué)分析提示II型NRG-1在自體神經(jīng)移植3-28天，對(duì)髓鞘的崩解，雪旺細(xì)胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。RT-PCR和Western blot顯示：II型NRG-1的mRNA和蛋白的表達(dá)均較Model組明顯減低。
　　結(jié)論：
　　II型NRG-1在SD大鼠自體神經(jīng)后神經(jīng)再生的的過程中，在移植的3-28天，對(duì)髓鞘的崩解，雪旺細(xì)胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。缺少II型NRG-1可能影響移植后神經(jīng)功能

11、的恢復(fù)。
　　實(shí)驗(yàn)三、P38-MAPK參與NRG-1調(diào)控大鼠自體神經(jīng)移植再生過程的機(jī)制研究
　　目的：
　　P38MAPK在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中對(duì)NRG-1/ErbB信號(hào)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
　　方法：
　　采用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，54只，體重250-300g隨機(jī)分為空白組（Blank）、緩沖液對(duì)照組（Model）和P38α MAPK抑制組（P38α MAPK），每組18只，按手術(shù)后3、7、14、21

12、、28、35天分為6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。Model組和P38α MAPK抑制組行自體坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)移植術(shù)，在術(shù)后當(dāng)日和第三天，Model組給予移植切口局部注射PBS緩沖液，P38α MAPK抑制組給予注射P38α MAPK抑制劑SB2035802；空白組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合不對(duì)其其他實(shí)驗(yàn)處理。在不同時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠足跡的變化，計(jì)算SFI，電生理檢測(cè)MNCV，透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)髓鞘堿性蛋白（MBP）mRNA

13、的變化，以及通過Western blot技術(shù)檢測(cè)P-P38α MAPK蛋白變化。
　　結(jié)果：
　　SD大鼠的SFI值在移植的7、14、21、28、35五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，P38α MAPK抑制組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于Model組。MNCV值顯示：在自體神經(jīng)移植的14、21、28、35天P38α MAPK抑制組的傳導(dǎo)速度小于Model組。在電鏡的髓鞘觀察和分析中有髓鞘神經(jīng)纖維的面積（um2）：P38α MAPK抑制組在第28、35天出現(xiàn)與

14、Model組明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），而前期無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；單位面積的有髓鞘神經(jīng)纖維的數(shù)量：P38α MAPK抑制組與Model組無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；軸突的直徑：在第21、28、35天出現(xiàn)P38α MAPK抑制組與Model組明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；對(duì)于G-ratio，在第28天和35天P38α MAPK抑制組均較Model組高且有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。Western blot和RT-PCR顯示：大鼠切口

15、局部注射SB203580后，MBP的mRNA：P38αMAPK抑制組的表達(dá)較Model組減少；P-P38α MAPK：P38α MAPK抑制組均較Model組少。
　　結(jié)論：
　　在SD大鼠自體神經(jīng)移植后，抑制P38α MAPK的激活，會(huì)出現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)減慢，有髓鞘神經(jīng)纖維的面積和軸突的直徑會(huì)減小，G-ratio值增加。提示在自體神經(jīng)移植模型中，P38α MAPK可能為NRG-1/ErbB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游信號(hào)，并對(duì)神經(jīng)