NRG-1調(diào)節(jié)α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)及平滑肌細(xì)胞收縮功能的分子機(jī)制.pdf

1、在成年的血管中，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth musclecells,VSMCs）的主要功能是通過(guò)收縮來(lái)調(diào)節(jié)血管的張力和直徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)由血壓和血液的分布。VSMCs存在增殖型和收縮型兩種表型。收縮型VSMCs可以表達(dá)多種平滑肌分化標(biāo)志基因，例如α-肌動(dòng)蛋白（smooth muscleα-actin,α-SMA）、肌球蛋白重鏈（SM-myosin heavy chain,MHC）、平滑肌蛋白22-α（smooth mus

2、cle protein22-α,SM22α）。血清反應(yīng)因子（serum response factor,SRF）通過(guò)募集myocardin、MRTF-A/B等輔助因子來(lái)調(diào)控平滑肌標(biāo)志基因的的表達(dá)。已經(jīng)證明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）是調(diào)節(jié)平滑肌標(biāo)志基因表達(dá)的重要細(xì)胞因子。
　　神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin-1,NRG-1）是含有表皮生長(zhǎng)因子（epidermal

3、 growth factor,EGF）樣結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一，由NRG基因通過(guò)選擇性地拼接所產(chǎn)生。NRG-1蛋白含有EGF樣的胞外結(jié)構(gòu)域和高度保守的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain,NRG-1-ICD）。NRG-1被基質(zhì)金屬蛋白酶水解后釋放出具有生物活性的可溶性 EGF片段，而NRG-1-ICD進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此外，NRG-1-ICD含有的LIM結(jié)構(gòu)域可以與和胞漿蛋白

4、相互作用。許多研究表明，NRG-1在心血管生理及病理過(guò)程中都發(fā)揮重要作用。首先，NRG-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而它的受體位于毗鄰的平滑肌細(xì)胞上。其次，在VSMCs中，NRG-1可以抑制由血小板源性生長(zhǎng)因子BB（platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB）引起的細(xì)胞增殖和遷移。再次，NRG-1可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能和參與對(duì)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。但是，TGF-β1誘導(dǎo)的VSMC分化是否需要 NRG-1

5、-ICD參與以及NRG-1-ICD如何調(diào)節(jié)VSMCs的功能目前尚無(wú)報(bào)道。
　　環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是最近被發(fā)現(xiàn)的對(duì)真核基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA。circRNA可以作為微小RNA（microRNA，miRNA）的“海綿”競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胞內(nèi) miRNA，阻斷miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，從而上調(diào)miRNA靶基因的表達(dá)。除此以外，circRNA也可通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding p

6、rotein，RBP)結(jié)合，或者與其他RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合而對(duì)特定基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。已經(jīng)證明，在血管組織中，circRNA cZNF292可以通過(guò)調(diào)節(jié)E2FI、NF-kB、Sp1、Ap1等轉(zhuǎn)錄因子的活性而調(diào)節(jié)血管的生成。在人的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，circANRIL在VSMCs和巨噬細(xì)胞中都有表達(dá)，其通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體的合成而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。然而在 VSMCs中是否存在circRNAs及 circRNAs對(duì)VSMCs的調(diào)節(jié)功能尚不清

7、楚。因此，本研究以TGF-β1作為VSMC分化的誘導(dǎo)因素，探索NRG-1-ICD和circRNA對(duì)VSMC功能的調(diào)節(jié)及作用機(jī)制。
　　第一部分：TGF-β1誘導(dǎo)合成的NRG-1-ICD參與VSMC細(xì)胞骨架的組構(gòu)
　　目的：
　　探討NRG-1是否在VSMC中進(jìn)行表達(dá)以及NRG-1-ICD在VSMC中的作用。
　　方法：
　　1.免疫熒光檢查NRG-1在小鼠血管組織中的表達(dá)，Western blot和RT-P

8、CR檢測(cè)NRG-1在不同種屬VSMC中的表達(dá)。
　　2.在VSMC中過(guò)表達(dá)NRG-1后，鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架及肌絲的變化。
　　3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察NRG-1過(guò)表達(dá)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮的影響。
　　4.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NRG-1-ICD和α-SMA的共定位。
　　5.免疫共沉淀檢測(cè)NRG-1、NRG-1-ICD與α-SMA的相互作用。
　　6.GST pull-down在體外驗(yàn)證NRG-1/NRG-1

9、-ICD與α-SMA的相互作用。
　　7.PLA實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)觀察NRG-1與α-SMA的作用。
　　結(jié)果：
　　1.在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（human artery smooth muscle cell，HASMC）中，TGF-β1上調(diào)NRG-1的表達(dá)
　　為了確定NRG-1是否在VSMC中表達(dá)，我們用NRG-1抗體對(duì)野生型C57BL/6小鼠的主動(dòng)脈血管進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示，NRG-1與平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白

10、α-SMA共定位。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示， NRG-1的mRNA和蛋白在大鼠VSMC，HASMC以及人血管內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達(dá)。
　　已知TGF-β1和PDGF-BB調(diào)節(jié)VSMC標(biāo)志基因的表達(dá)，但它們是否影響NRG-1的表達(dá)目前尚不清楚。分別用10 ng/mL的PDGF-BB和2 ng/mL的TGF-β1刺激細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、24 h)。提取總RNA和總蛋白進(jìn)行Real-time PCR和Weste

11、rn blot分析。結(jié)果顯示，隨著PDGF-BB刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，NRG-1的表達(dá)逐漸降低。相反，隨著TGF-β1刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，NRG-1的表達(dá)逐漸增加。
　　2.NRG-1-ICD參與細(xì)胞骨架的組構(gòu)
　　為了研究NRG-1在VSMC中的作用，用攜帶NRG-1基因的腺病毒感染細(xì)胞24 h后，觀察細(xì)胞骨架的變化。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NRG-1可以促進(jìn)肌絲成束，使應(yīng)力纖維增粗。
　　因?yàn)镹RG-1含有EGF樣的胞外

12、結(jié)構(gòu)域（ECD）和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（ICD），我們進(jìn)一步檢查NRG-1的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞骨架發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用HRG-β1（可溶性活性成分）處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞骨架不發(fā)生明顯的變化。然而，過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD后，細(xì)胞骨架出現(xiàn)束狀排列。這些結(jié)果表明，NRG-1對(duì)細(xì)胞骨架的組構(gòu)主要是通過(guò)NRG-1-ICD實(shí)現(xiàn)的。我們還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NRG-1可以促進(jìn)乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮
　　3.TGF-β1促進(jìn)NRG-1/NRG-1-ICD與α-S

13、MA的相互作用
　　為了進(jìn)一步檢查NRG-1-ICD參與細(xì)胞骨架的組構(gòu)是否和其與α-SMA相互作用有關(guān)，我們用檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)檢查二者的結(jié)合。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在未經(jīng)TGF-β1處理的HASMC中，NRG-1-ICD和α-SMA表達(dá)水平較低。TGF-β1刺激12 h后，二者的表達(dá)明顯增加，而且二者在細(xì)胞漿中共定位。從被TGF-β1刺激后的HASMC中提取蛋白質(zhì)，經(jīng)抗α-SMA抗體免疫沉淀后，用抗NRG-1和抗NRG-1

14、-ICD的抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)水平時(shí)，NRG-1/NRG-1-ICD均與α-SMA結(jié)合，TGF-β1刺激12 h后，二者之間的結(jié)合明顯增加。GST pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在TGF-β1可以直接增強(qiáng)NRG-1/NRG-1-ICD與α-SMA的相互作用，與免疫共沉淀的結(jié)果相一致。PLA實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，NRG-1與α-SMA存在相互作用。這些結(jié)果表明，NRG-1-ICD通過(guò)與α-SMA的相互作用而

15、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組構(gòu)。
　　小結(jié)：
　　綜上所述，TGF-β1可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上上調(diào)NRG-1表達(dá)；NRG-1的ICD結(jié)構(gòu)域通過(guò)與α-SMA相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組構(gòu)，參與細(xì)胞收縮；TGF-β1促進(jìn)NRG-1/NRG-1-ICD與α-SMA的相互作用。
　　第二部分：circACTA2介導(dǎo)NRG-1-ICD對(duì)α-SMA表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　目的：
　　揭示NRG-1-ICD調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)的作用機(jī)制。
　　

16、方法：
　　1.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NRG-1-ICD的細(xì)胞定位。
　　2.ChIP法檢測(cè)NRG-1-ICD在α-SMA基因第一內(nèi)含子上的富集。
　　3.熒光素酶報(bào)告基因分析鑒定NRG-1-ICD在α-SMA基因第一內(nèi)含子上的結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.分別在 HASMC中過(guò)表達(dá)或敲低NRG-1-ICD，Western blot檢測(cè)α-SMA的表達(dá)變化。
　　5.qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD后α-SMA

17、mRNA表達(dá)變化。
　　6.RT-PCR和RNaseR處理后，qRT-PCR檢測(cè)線性和環(huán)狀RNA。
　　7.CRISPRi封閉NRG-1-ICD結(jié)合位點(diǎn)，qRT-PCR檢測(cè)circACTA2和α-SMA mRNA的變化。
　　8.過(guò)表達(dá) NRG-1-ICD后再給與TGF-β1刺激，qRT-PCR檢測(cè)circACTA2的表達(dá)。
　　9.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低circACTA2對(duì)α-SMA表達(dá)的影響

18、。
　　結(jié)果：
　　1.在HASMC中，NRG-1-ICD上調(diào)α-SMA的表達(dá)
　　細(xì)胞免疫熒光染色顯示，在靜止的HASMC中，NRG-1-ICD在胞漿和胞核均有分布，但以胞漿居多。TGF-β1刺激12 h后，NRG-1-ICD在胞漿和胞核中都增多，胞核中增加更為明顯。為了確定NRG-1-ICD的作用位點(diǎn)，我們進(jìn)行了Chromatin Immunoprecipitation Sequencing(ChIP-Seq)分析

19、。在TGF-β1刺激細(xì)胞12 h后,用NRG-1-ICD抗體沉淀染色質(zhì)片段。高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，α-SMA基因第一內(nèi)含子（+5642 bp/+5787 bp區(qū)域）的DNA片段被NRG-1-ICD抗體所沉淀。我們進(jìn)一步用ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)ChIP-Seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激后，NRG-1-ICD與α-SMA基因第一內(nèi)含子+5642 bp/+5787 bp的相互作用增強(qiáng)。構(gòu)建NRG-1-I

20、CD-binding site和NRG-1-ICD-binding site mut熒光素酶報(bào)告基因載體，與NRG-1-ICD表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后，觀察NRG-1-ICD過(guò)表達(dá)對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD后，野生型NRG-1-ICD-binding site指導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的活性明顯升高，但是突變位點(diǎn)對(duì)熒光素酶表達(dá)沒有明顯影響。這些結(jié)果說(shuō)明，NRG-1-ICD通過(guò)與α-SMA基因第一內(nèi)含子區(qū)+5642

21、 bp/+5787 bp的相互作用上調(diào)α-SMA表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步明確NRG-1-ICD在TGF-β1促進(jìn)α-SMA表達(dá)中的作用，我們用攜帶NRG-1-ICD基因的腺病毒感染細(xì)胞后，再給予TGF-β1刺激24 h，觀察α-SMA的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1可以誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)，NRG-1-ICD過(guò)表達(dá)可進(jìn)一步增加α-SMA的表達(dá)水平。利用靶向NRG-1-ICD的siRNA轉(zhuǎn)染HASMC24 h，檢

22、測(cè)TGF-β1對(duì)α-SMA的影響。結(jié)果顯示，敲低NRG-1-ICD后，α-SMA表達(dá)水平明顯降低，即使再給予TGF-β1處理仍不能恢復(fù)α-SMA的表達(dá)水平。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD不影響α-SMA mRNA水平。
　　2.NRG-1-ICD誘導(dǎo)circACTA2的形成
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRG-1可以上調(diào)α-SMA的蛋白水平，但不影響其mRNA。由此，我們推測(cè)，NRG-1可能在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)miRNA

23、或者是circRNA對(duì)α-SMA表達(dá)起調(diào)控作用。為了驗(yàn)證這個(gè)假說(shuō)，我們?cè)O(shè)計(jì)針對(duì)circACTA2反向連接處的引物，以互補(bǔ)DNA（cDNA）和基因組DNA（gDNA）為模板進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示，以cDNA為模板可以擴(kuò)增出circACTA2連接處的DNA片段，而以gDNA為模板卻不能擴(kuò)增出此片段。由于circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)核糖核酸酶R(RNase R)不敏感，線性RNA則不然，所以利用RNase R處理可以區(qū)別circRNA與線性

24、RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNase R處理使線性ACTA2（α-SMA mRNA）降低90％，而circACTA2只降低40%。我們用針對(duì)全長(zhǎng)circACTA2的引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，全長(zhǎng) circACTA2的長(zhǎng)度約為730 bp。這些結(jié)果說(shuō)明，HASMC中存在circACTA2。
　　為了研究NRG-1-ICD是否可以影響 circACTA2的形成，我們用CRISPR interference（CRISPRi）封閉技術(shù)，即用

25、dCas9+gRNA阻斷RNA聚合酶II與NRG-1-ICD結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，觀察circACTA2表達(dá)變化。合成一段與NRG-1-ICD結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的單鏈gRNA，它通過(guò)介導(dǎo)Cas9酶與α-SMA基因第一內(nèi)含子結(jié)合而阻斷轉(zhuǎn)錄的起始及延伸。qRT-PCR結(jié)果顯示,封閉NRG-1-ICD結(jié)合位點(diǎn)后circACTA2表達(dá)降低，而α-SMA mRNA沒有變化。并且我們還發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)給予TGF-β1刺激或者過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD均可以使circA

26、CTA2的表達(dá)增高，同時(shí)給予二者時(shí)，會(huì)進(jìn)一步增加circACTA2的表達(dá)水平。
　　3.circACTA2介導(dǎo)TGF-β1對(duì)α-SMA表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　我們?cè)O(shè)計(jì)兩個(gè)siRNA,一個(gè)特異性敲低circACTA2（si-circACTA2）,另一個(gè)是同時(shí)敲低環(huán)狀和線狀A(yù)CTA2（si-both）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲低circACTA2不影響α-SMA mRNA水平；同時(shí)敲低環(huán)狀和線狀RNA時(shí)，會(huì)使circACTA2和α-SMA

27、mRNA的水平均下降。Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)或者敲低circACTA2分別增加或降低α-SMA蛋白水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circACTA2是否介導(dǎo)TGF-β1對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)的影響，我們過(guò)表達(dá) circACTA2后再給予TGF-β1處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) circACTA2可以進(jìn)一步增強(qiáng)TGF-β1對(duì)α-SMA表達(dá)的上調(diào)作用。反之，敲低circACTA2則降低TGF-β1對(duì)α-SMA表達(dá)的誘導(dǎo)。
　　小結(jié)：

28、r>　　綜上所述，circACTA2介導(dǎo)TGF-β1和NRG-1-ICD對(duì)α-SMA表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　第三部分：circACTA2通過(guò)吸附miR-548f-5p上調(diào)α-SMA表達(dá)及調(diào)節(jié)HASMC功能
　　目的：
　　揭示circACTA2調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)及VSMC功能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建帶有熒光素酶活性的野生型 pmirGLO-circACTA2和突變型pmirGLO-circACTA2

29、 mut質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后進(jìn)行雙熒光素報(bào)告基因分析。
　　2.生物素標(biāo)記 circACTA2和miR-548f-5p，經(jīng)oligo-pull down和qRT-PCR檢測(cè)被富集的miR-548f-5p和circACTA2。
　　3.原位雜交檢查miR-548f-5p和circACTA2在細(xì)胞中的共定位。
　　4.合成α-SMA3’UTR及其突變體DNA片段，克隆進(jìn)pmir-GLO載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后進(jìn)行報(bào)

30、告基因分析。
　　5.過(guò)表達(dá)或敲低miR-548f-5p, Western blot觀察α-SMA蛋白的表達(dá)水平。
　　6.分別過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD敲低circACTA2或miR-548f-5p后，western blot檢測(cè)α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　7.觀察NRG-1-ICD、circACTA2、miR-548f-5p對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮的影響。
　　結(jié)果：
　　1.circACTA2作為分子“

31、海綿”吸附miR-548f-5p
　　用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)circACTA2上 microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)circACTA2上存在1個(gè)miR-548f-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，暗示circACTA2可能與miR-548f-5p相互作用。我們構(gòu)建帶有熒光素酶基因的野生型pmirGLO-circACTA2和突變型pmirGLO-circACTA2 mut質(zhì)粒，將其與miR-548f-5p模擬物共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。報(bào)告基因分析結(jié)果顯示

32、，野生型pmirGLO-circACTA2指導(dǎo)的熒光素酶活性能被miR-548f-5p模擬物所抑制，但miR-548f-5p模擬物對(duì)突變型pmirGLO-circACTA2 mut指導(dǎo)的熒光素酶活性沒有影響。
　　用生物素標(biāo)記的circACTA2對(duì)RNA提取物進(jìn)行 oligo-pull down，qRT-PCR分析其富集的miRNAs。結(jié)果顯示，與對(duì)照探針組相比，circACTA2探針組的miR-548f-5p富集量明顯增加。反之

33、，用標(biāo)記生物素的miR-548f-5p作為探針，經(jīng) oligo-pull down和 qRT-PCR分析被miR-548f-5p富集的circRNAs。結(jié)果表明，與對(duì)照探針組相比，miR-548f-5p探針組的circACTA2富集量也有所增加。原位雜交實(shí)驗(yàn)也證實(shí)circACTA2在細(xì)胞內(nèi)與miR-548f-5p共定位。此外，TGF-β1刺激和NRG-1-ICD過(guò)表達(dá)都可以使miR-548f-5p的表達(dá)水平降低，二者聯(lián)合時(shí)降低更為顯著。

34、這些結(jié)果表明，circACTA2可以作為分子“海綿”吸附miR-548f-5p。
　　2.在VSMC中，miR-548f-5p通過(guò)靶向α-SMA3’UTR而抑制其蛋白表達(dá)
　　我們發(fā)現(xiàn)，α-SMA3’非編碼區(qū)（UTR序列）含有miR-548f-5p的結(jié)合位點(diǎn)。將含有miR-548f-5p結(jié)合位點(diǎn)的α-SMA及其突變體3’UTR克隆到攜帶熒光素酶基因的pmir-GLO質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后進(jìn)行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，含

35、有野生型miR-548f-5p結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因的表達(dá)活性能被miR-548f-5p模擬物所抑制，而其突變體不能被模擬物所抑制。分別用 miR-548f-5p的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染HASMC，qRT-PCR證實(shí)miR-548f-5p在細(xì)胞中得到過(guò)表達(dá)和敲低。Western blot結(jié)果顯示， miR-548f-5p mimic能使α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低，而anti-miR-548f-5p對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)影響不大。以上結(jié)果表明，

36、在HASMC中，miR-548f-5p通過(guò)直接與α-SMA3'UTR結(jié)合來(lái)抑制其蛋白的表達(dá)。
　　3.NRG-1/circACTA2/miR-548f-5p形成調(diào)節(jié)軸共同調(diào)節(jié)VSMC的收縮功能
　　在HASMC中，用siRNA靶向敲低circACTA2后再用腺病毒過(guò)表達(dá)NRG-1-ICD，檢查其對(duì)α-SMA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，敲低circACTA2能顯著抑制 NRG-1-ICD過(guò)表達(dá)對(duì)α-SMA表達(dá)的上調(diào)。相反，過(guò)表達(dá)ci

37、rcACTA2則進(jìn)一步增加NRG-1-ICD過(guò)表達(dá)對(duì)α-SMA表達(dá)的上調(diào)。這些結(jié)果表明，circACTA2介導(dǎo)NRG-1-ICD對(duì)α-SMA表達(dá)的上調(diào)作用。共表達(dá)circACTA2和NRG-1-ICD可以顯著增加乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮。
　　我們進(jìn)一步用miR-548f-5p的抑制物和靶向circACTA2的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢查其對(duì)α-SMA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，用 anti-miR-548f-5p拮抗miR-548f-5p的

38、作用后，α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯增加。然而，敲低circACTA2則明顯抑制α-SMA的表達(dá)。相反，circACTA2過(guò)表達(dá)增加α-SMA的表達(dá)，并且過(guò)表達(dá)circACTA2和抑制miR-548f-5p可進(jìn)一步增加α-SMA的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，circACTA2可以作為分子“海綿”吸附miR-548f-5p，解除其對(duì)靶基因α-SMA的抑制。我們還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)circACTA2和抑制miR-548f-5p可以增加乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞

39、收縮。這些結(jié)果提示，NRG-1、circACTA2和miR-548f-5p形成調(diào)節(jié)軸共同對(duì)α-SMA表達(dá)和VSMC功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　小結(jié)：
　　circACTA2作為分子“海綿”吸附miR-548f-5p,解除其對(duì)靶基因α-SMA的抑制作用；NRG-1、circACTA2和 miR-548f-5p形成調(diào)節(jié)軸共同調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)及VSMC的收縮功能。
　　結(jié)論：
　　1.TGF-β1可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上上調(diào)