心肌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子E47與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的關(guān)系初探.pdf

1、核轉(zhuǎn)錄因子E47是E2A基因編碼的兩個(gè)不同堿性螺旋環(huán)（basic Helix-Loop-Helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子（E12和E47）之一，亦稱Transcription Factor-3（TCF-3）。E47通過(guò)形成同源或異源二聚體，結(jié)合于目的基因上游啟動(dòng)子的順式作用元件E-box而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。課題組前期利用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia reperfusion，H/R）后可引起核轉(zhuǎn)錄

2、因子E47活性明顯上調(diào)。文獻(xiàn)報(bào)道，E47通過(guò)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)的兩個(gè)基因——鈣黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）的上游啟動(dòng)子的E-box順式作用元件結(jié)合，上調(diào)α-SMA的表達(dá)，并下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促使上皮細(xì)胞表型發(fā)生變化，而失去上皮細(xì)胞特征和獲得肌纖維母細(xì)胞樣表性。為此，

3、E47在心肌細(xì)胞H/R過(guò)程中活性增高，是否也會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)變化，使心肌細(xì)胞獲得肌纖維母細(xì)胞樣表型呢？
　　目的：
　　初步探討心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后核轉(zhuǎn)錄因子E47與α-SMA的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采用差速貼壁法體外培養(yǎng)Sprague-Dawly大鼠新生乳鼠原代心肌細(xì)胞及H9c2大鼠心肌細(xì)胞株。
　　2. Real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）后E47和α-SMA

4、mRNA的表達(dá)水平的變化。
　　3. Western-blot測(cè)定心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）后E47、α-SMA的蛋白表達(dá)水平的變化。
　　4.免疫熒光法觀察H/R前后E47和α-SMA在細(xì)胞中的表達(dá)定位及變化。
　　5.利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）在E47表達(dá)最高時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其與α-SMA啟動(dòng)子E-box序列的結(jié)合活性。
　　結(jié)果：

5、r>　　1. E47蛋白及mRNA的表達(dá)水平在原代心肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞 H/R后均出現(xiàn)表達(dá)增高現(xiàn)象，以H3h/R2h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)最高，此后隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)E47表達(dá)逐漸降低。
　　2.α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)水平在原代心肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞 H/R后均未出現(xiàn)明顯變化。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示，E47在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)均有表達(dá)，H3h/R2h后在細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的表均有所上升；而α-SMA則主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且H3h/R2