法舒地爾在大鼠視神經(jīng)損傷再生中的作用及對(duì)CNTF、NRG-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:視神經(jīng)損傷是目前臨床上重要的致盲性眼病之一，主要表現(xiàn)為患者視力急劇下降、視野異常、對(duì)光反射障礙等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，視神經(jīng)損傷后，近半數(shù)患者將永久失明[1]。如何在視神經(jīng)損傷后促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生及恢復(fù)視功能是眼科臨床和科研工作中的一個(gè)棘手問題。有病理學(xué)研究表明，視神經(jīng)損傷后引起視力喪失的根源是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglioncells，RGCs)的大量壞死以及神經(jīng)軸突的退行性改變[2]。RGCs壞死及軸突再生受體內(nèi)多種小分子

2、共同調(diào)節(jié)，如神經(jīng)營養(yǎng)因子、凋亡抑制因子缺乏，炎性因子表達(dá)上升等等。研究發(fā)現(xiàn)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophicfactor，CNTF)及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(Neuregulin-1，NRG-1)在減少RGCs凋亡、抑制繼發(fā)性炎癥反應(yīng)、促進(jìn)軸突生長等神經(jīng)保護(hù)方面作用顯著。CNTF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損軸突再生等多種途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。NRG-1是一種在細(xì)胞生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的小分子蛋

3、白，可以通過抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)參與受損神經(jīng)的保護(hù)過程。目前研究發(fā)現(xiàn)早期藥物治療可以保護(hù)視神經(jīng)，改善視神經(jīng)損傷患者的預(yù)后。臨床上常用藥物如抗氧化劑、激素等副作用大，治療效果不明顯。尋找一種安全有效且副作用小的治療藥物備受眼科同仁的關(guān)注。法舒地爾是一種Rho激酶(Rho-associated kinases，ROCK)抑制劑，為目前臨床上常見的新型血管擴(kuò)張劑。目前，法舒地爾在心腦血管系統(tǒng)疾病的療效已被臨床證實(shí)，其在抑制炎癥、趨化細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、

4、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和分化等神經(jīng)保護(hù)方面的作用也越來越受到廣泛關(guān)注。但是目前關(guān)于法舒地爾神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究都集中在腦、脊髓損傷方面，而視神經(jīng)保護(hù)方面的報(bào)道卻很罕見。
　　本次實(shí)驗(yàn)通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)不同組大鼠RGCs的數(shù)量及形態(tài)，并應(yīng)用免疫組化及計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)對(duì)CNTF、NRG-1在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行半定量測(cè)定，探討法舒地爾在視神經(jīng)損傷后對(duì)RGCs的保護(hù)作用及對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)CNTF、NRG-1表達(dá)的影響，為今后臨床上視神經(jīng)損傷的治療

5、提供新思路。
　　方法:將60只雄性無眼病清潔級(jí)SD大鼠作為研究對(duì)象，體重(200±20)g。將其隨機(jī)分三組，正常組12只、生理鹽水組（對(duì)照組）24只、法舒地爾組（治療組）24只。在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中建立右眼視神經(jīng)不完全損傷模型，正常組雙眼不做處理，對(duì)照組與治療組均以右眼為模型。于建模1小時(shí)后每天一次，對(duì)照組腹腔注射10mg/kg生理鹽水，治療組腹腔注射法舒地爾10mg/kg，正常組不處理。在視神經(jīng)損傷后3、7、14、21天時(shí)隨機(jī)抽

6、取正常組3只大鼠、對(duì)照組與治療組6只大鼠，正常組大鼠取雙側(cè)眼球，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組取大鼠右側(cè)眼球制作視盤上方2mm處切片。HE染色后顯微鏡觀察切片視網(wǎng)膜的損傷情況并計(jì)數(shù)RGCs數(shù)量，免疫組化染色后通過計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜平均光密度值(averageoptical density, AOD)，觀察視網(wǎng)膜內(nèi)CNTF、NRG-1的表達(dá)情況，染色后計(jì)算機(jī)分析得出的AOD值代表抗原表達(dá)量，AOD值越高表示CNTF、NRG-1陽性表達(dá)越強(qiáng)。使用

7、SPSS13.0軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為正態(tài)分布計(jì)量資料，統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。同時(shí)間點(diǎn)三組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一組不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組視網(wǎng)膜組織蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色后光鏡觀察
　　1.1形態(tài)學(xué)改變
　　正常組:RGCs呈圓形、橢圓形單層緊密排列

8、，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)整。各層細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞核清晰可見，染色清楚。
　　對(duì)照組:光鏡下，損傷初期即可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層部分細(xì)胞水腫，中期可見RGCs排列松散，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變，細(xì)胞數(shù)目也較早期降低，并伴隨著出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、裂解。視網(wǎng)膜各層排列均不規(guī)則并逐漸變薄。
　　治療組:各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜均有不同程度的病理改變，但強(qiáng)于同時(shí)間段的對(duì)照組。
　　1.2視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的改變
　　采用×400的顯微鏡觀

9、察，各時(shí)間點(diǎn)正常組大鼠RGCs數(shù)量相比無差別（P＞0.05）;對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)平均RGCs數(shù)分別為18.114±1.159、12.093±1.205、6.866±1.188、3.408±1.464;治療組分別為21.973±1.067、18.028±1.346、11.673±1.098、8.672±0.993。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組RGCs數(shù)目均逐漸減少且各時(shí)間點(diǎn)RGCs計(jì)數(shù)均低于正常組(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組R

10、GCs數(shù)均低于治療組（P＜0.05）。
　　2、視網(wǎng)膜CNTF、NRG-1免疫組化半定量檢測(cè)
　　2.1 CNTF在視網(wǎng)膜中的表達(dá)
　　在正常組大鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、雙極細(xì)胞層、感光細(xì)胞層均可見到棕褐色染色的CNTF存在，其它各層也可見少量CNTF彌漫分布。視神經(jīng)損傷3天后可見視網(wǎng)膜內(nèi)CNTF表達(dá)增多。正常組3、7、14、21天視網(wǎng)膜CNTF的AOD分別為:0.126±0.004、0.125±0.017、0.129

11、±0.006、0.128±0.039，各時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;對(duì)照組視網(wǎng)膜CNTF的AOD分別為:0.231±0.016、0.319±0024、0.244±0.013、0.169±0.009;治療組各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜CNTF的AOD均高于對(duì)照組，為0.257±0.021、0.344±0.034、0.289±0.006、0.225±0.022。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)CNTF在視神經(jīng)損傷3天時(shí)表達(dá)增加，在7天達(dá)到頂峰后逐漸衰

12、減，3-21天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)CNTF表達(dá)均高于正常組(P＜0.05)。治療組各時(shí)間視網(wǎng)膜中CNTF陽性表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組和正常組（P＜0.05）。
　　2.2 NRG-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)
　　正常組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可見NRG-1少許表達(dá)，主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和雙極細(xì)胞層，陽性反應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色濃染。正常組3、7、14、21天視網(wǎng)膜NRG-1的AOD分別為0.117±0.014、0.121±0.015、0.119±0.0

13、20、0.124±0.027;對(duì)照組分別為:0.143±0.016、0.215±0.018、0.255±0.022、0.183±0.021;治療組分別為:0.158±0.022、0.231±0.019、0.312±0.025、0.252±0.023。如上所示，視神經(jīng)損傷三天時(shí)對(duì)照組NRG-1表達(dá)較正常組升高，在損傷14天達(dá)到峰值后逐漸減弱，21天時(shí)表達(dá)量仍明顯高于正常組，3-21天對(duì)照組NRG-1表達(dá)量均高于正常組(P＜0.05)。而治

14、療組中，各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜內(nèi)表達(dá)的NRG-1均高于正常組與對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)量減少，視網(wǎng)膜各層排列松散，腹腔注射法舒地爾后可以減輕RGCs損傷，減少細(xì)胞數(shù)目丟失，說明法舒地爾對(duì)損傷后的視神經(jīng)具有保護(hù)作用。
　　2、視神經(jīng)損傷后，對(duì)照組與治療組各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜CNTF的表達(dá)較正常組均有上升，說明CNTF參與了視神經(jīng)損傷后神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的過程。
　　3、視神經(jīng)損傷后，對(duì)照組