海人酸誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致神經(jīng)元的毒性機(jī)制及褪黑素的保護(hù)作用研究.pdf

1、本文對(duì)海人酸誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致神經(jīng)元的毒性機(jī)制及褪黑素的保護(hù)作用進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：海人酸誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及褪黑素的保護(hù)作用。
　　目的：在C57BL/6J小鼠體內(nèi)和Neuro-2a細(xì)胞中探討海人酸（kainic acid，KA）誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制以及褪黑素（melatonin，MT）的保護(hù)作用。

2、r>　　方法：首先，將C57BL/6J小鼠分為六組，即①對(duì)照（CON）組；②海人酸（KA）組；③海人酸與褪黑素共處理（KA+MT）組；④褪黑素（MT）組；⑤海人酸與4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）共處理（KA+PBA）組；⑥4-苯基丁酸（PBA）組。用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測方法檢測 ERS標(biāo)志分子 Bip和 CHOP以及ERS特異性的凋亡分子Caspase-12及其下游效應(yīng)分子Caspase-3 mRNA水

3、平表達(dá)情況，用甲苯胺藍(lán)染色方法檢測小鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)，用水迷宮檢測方法檢測小鼠空間記憶能力。其次，在 Neuro-2a細(xì)胞中驗(yàn)證上述動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)一步在Neuro-2a細(xì)胞中通過鈣離子熒光探針Fura-2/AM和熒光成像系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，用熒光酶標(biāo)儀檢測Calpain的活性變化。
　　結(jié)果：①KA刺激C57BL/6J小鼠后，ERS標(biāo)志性分子Bip和CHOP在mRNA水平明顯上調(diào)，ERS特異性凋亡分子 Ca

4、spase-12及其下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子Caspase-3在mRNA水平表達(dá)均顯著升高；MT可顯著抑制C57BL/6J小鼠體內(nèi)KA誘發(fā)的ERS，對(duì)抗KA誘導(dǎo)ERS介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，同時(shí)MT對(duì)KA引起的小鼠空間記憶功能障礙有顯著的保護(hù)作用。②在體外 Neuro-2a細(xì)胞中驗(yàn)證了上述結(jié)果：與對(duì)照組相比，KA作用3h后Neuro-2a細(xì)胞中Bip，CHOP，Caspase-12，Caspase-3在mRNA水平表達(dá)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

5、顯著增加，同時(shí)Calpain酶活性明顯增加；MT處理Neuro-2a細(xì)胞后可有效抑制KA誘發(fā)的ERS及ERS介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，同時(shí)MT可有效抑制KA引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及Calpain活性的增加。
　　結(jié)論：在C57BL/6J小鼠和Neuro-2a細(xì)胞中，KA可誘發(fā)ERS途徑介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡；MT通過抑制ERS進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡。
　　第二部分：海人酸引起tau蛋白過度磷酸化的分子機(jī)制及褪黑素的保護(hù)作用。
　　目的

6、：在 C57BL/6J小鼠體內(nèi)和 HEK293/Tau細(xì)胞中探討海人酸（KA）誘導(dǎo)的ERS引起的tau蛋白過度磷酸化以及MT的保護(hù)作用。
　　方法：首先，將HEK293/Tau細(xì)胞分為四組，即①對(duì)照（CON）組；②海人酸（KA）組；③海人酸與褪黑素共處理（KA+MT）組；④褪黑素（MT）組。采用Western blotting方法檢測tau蛋白在ps202和ps404位點(diǎn)的磷酸化水平，并通過放射性同位素γ-32P標(biāo)記的酶活性測定法

7、檢測磷酸化激酶GSK3和CDK5的活性變化情況，同時(shí)用熒光酶標(biāo)儀檢測 Calpain的活性變化。其次，在C57BL/6J小鼠海馬組織內(nèi)采用免疫組織化學(xué)和Western blotting方法檢測tau蛋白ps202和ps404位點(diǎn)磷酸化水平，驗(yàn)證上述細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果：①KA處理HEK293/Tau細(xì)胞后tau蛋白在ps202和ps404位點(diǎn)磷酸化水平顯著增加，同時(shí)增加GSK3，CDK5和Calpain活性；MT可對(duì)抗KA