神經(jīng)元內(nèi)Munc-18蛋白的漏出及其在神經(jīng)元表面的分布.pdf

1、Munc-18是一種67kDa的突觸前膜胞內(nèi)蛋白,在突觸囊泡釋放過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。從Rasmussen's腦炎患兒血清中檢測到抗Munc-18自身抗體后,對這種自身抗體功能的研究陸續(xù)開展,本室的前期研究顯示抗Munc-18抗體對SD大鼠有致癇作用,但其致癇機(jī)制仍不明確。對Munc-18抗原來源和Munc-18抗體其他功能的研究尚未見報(bào)道,我們在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和SD大鼠上對這兩方面進(jìn)行初步研究。主要研究結(jié)果如下:
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2、.沉淀正常原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元生長培養(yǎng)液中的蛋白,進(jìn)行westernblot檢測發(fā)現(xiàn)Munc-18可以進(jìn)入細(xì)胞外液;活細(xì)胞免疫熒光染色顯示Munc-18分布在細(xì)胞表面和神經(jīng)突起末梢;免疫電鏡觀察顯示正常和海人藻酸誘導(dǎo)的癲癇SD大鼠海馬,Munc-18分布在細(xì)胞問隙和突觸間隙。
　　2.在50μM谷氨酸刺激原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元興奮后,用細(xì)胞表面生物素化技術(shù)標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞表面蛋白,westernblot檢測發(fā)現(xiàn)用親和素分離的生物素化胞膜

3、表面蛋白中Munc-18明顯增多,進(jìn)入細(xì)胞外液的Munc-18也隨之增加,而此時神經(jīng)元LDH釋放水平并沒有增加;隨谷氨酸作用時間的延長,細(xì)胞外液中的Munc-18又逐漸減少同時免疫細(xì)胞熒光染色顯示Munc-18在更廣泛的神經(jīng)突起及其末梢部位分布。
　　3.在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,1:1000的anti-Munc-18Nterminal抗體作用1小時對Munc-18進(jìn)入細(xì)胞外液有明顯的促進(jìn)作用,此時神經(jīng)元LDH釋放水平并沒有增加。<

4、br>　　4.30mMKCI刺激皮層神經(jīng)元興奮15分鐘時細(xì)胞膜表面Munc-18明顯增加,隨時間延長至45分鐘,細(xì)胞表面的含量逐漸下降。
　　5.1:100～1:800的識別Munc-18氨基末端的抗體可抑制30mMKC1誘發(fā)突觸小體釋放谷氨酸活動:Munc-18氨基末端抗體不影響突觸小體內(nèi)鈣離子濃度;鈣離子不影響KCl刺激下突觸小體胞膜表面Munc-18的含量。我們認(rèn)為Munc-18分布在細(xì)胞膜表面,跨越細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞外液可能