gaba免疫陽性神經(jīng)元在三黃雞小腦內(nèi)的分布

1、第 2 9 卷 第 5 期 2 0 1 0年 1 O 月 華 中 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) J o u r n a lo fHu a z h o n gAg r i c u l t u r a lUn i v e r s i t yVo l _ 2 9No ． 5Oc t ． 2 0 1 0 ， 5 9 7 ~ 6 0 0G A B A免 疫 陽性神 經(jīng) 元 在 三 黃雞 小 腦 內(nèi)的分 布 羅厚強(qiáng)彭克美 一王家 鄉(xiāng)唐 麗程佳月張高英宋

2、卉 劉華珍 華 中 農(nóng) 業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 武漢 4 3 0 0 7 0摘要 為探 明三黃雞小腦皮質(zhì)各層 的細(xì)胞 構(gòu)筑和 G A B A 免疫反應(yīng) 神經(jīng)元 在其小腦 內(nèi)的分 布情況 ， 采用尼 氏染色和免疫 組織化學(xué) S A B C技 術(shù) ， 對(duì) 1 O 羽 三黃雞 的小腦進(jìn)行 了研究 。研究發(fā)現(xiàn) ： 三黃雞小腦皮質(zhì)各 層的細(xì)胞 構(gòu)筑與北京鴨、 烏雞 、 鴿子 和非洲鴕 鳥的大體相似 ； G A B A免疫 陽性細(xì)胞位 于小 腦皮質(zhì)

3、的蒲肯野 細(xì)胞層 中， 陽性 較明顯 ； 小腦 中央核也有大量陽性神經(jīng)元 ， 多數(shù)呈梭形或不規(guī)則多邊形 ， 多數(shù)神經(jīng)元胞質(zhì)呈強(qiáng) 陽性染 色 。以上結(jié) 果 表明 ： G A B A陽性神 經(jīng)元在 三 黃雞 小腦 皮質(zhì) 各層 均 有分 布 ， G A B A可 能在 介導(dǎo) 小腦 復(fù) 雜功 能 中發(fā) 揮重 要 作用。關(guān)鍵詞 三黃雞 ； 細(xì)胞 構(gòu)筑 ； 小腦 ； 7 - 氨基丁酸 中圖分類號(hào) S8 5 2 ． 1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1 0

4、0 0 — 2 4 2 1 ( 2 0 1 0 ) 0 5 — 0 5 9 7 — 0 4禽類小腦作為腦 的第二大結(jié)構(gòu) ， 是動(dòng)物軀體重 要的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié) 中樞 ， 具有保持軀體平衡、 調(diào)節(jié)肌緊張 和協(xié)調(diào)隨意運(yùn)動(dòng)的作用， 而這些功能的完成都與小 腦皮質(zhì)有著密切 的關(guān)系。氨基 丁酸( g a mma - a mi —n o b u t y r i ca c i d ， G A B A ) 是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物 神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)

5、， 在動(dòng)物體 內(nèi)起著十 分重要的作用。G A B A存 在于哺乳動(dòng)物和人 的小 腦皮質(zhì)中早 已有過報(bào)道E I - 2 ] ， 但 G A B A 陽性神經(jīng)元 在三黃雞小腦 的定位和分布未見報(bào)道。本試驗(yàn) 以三 黃雞為對(duì)象 ， 探討 G A B A 陽性神經(jīng)元在三黃雞小腦 內(nèi)的分布規(guī)律 ， 旨 在為進(jìn)一步研究三黃雞 G A B A 的 生理功能及其作用機(jī)制提供理論依據(jù) 。1 材料與方法 1 ． 1 材料及 處理 成年健康三黃雞 l 0 羽

6、， 購(gòu) 自湖北省種雞場(chǎng) ， 雌 雄不限， 平均體質(zhì)量 1 ． 2 ～1 ． 4k g 。用氨基 甲酸乙酯按每千克體質(zhì)量 1g的劑量， 經(jīng)生理鹽水稀 釋成 1 O， 經(jīng)跖靜脈注射全身麻醉。然后 ， 分別用生理鹽 水和 4多聚甲醛磷酸緩 沖固定液 ( p H7 ． 4 ) 經(jīng)左心 室灌流固定。固定完全后迅速開顱取小腦 ， 石蠟包 埋 ， 制成 5t L m厚的縱向連續(xù)切片( 矢狀切面) ， 每隔 4 片取 1 片 ， 切片分為 3 套 。第

7、 1 套采用尼氏染色，觀察細(xì)胞的構(gòu)筑。第 2 套采用免疫組化 S A B C法染 色 ， 一抗及 S A B C試劑 盒均購(gòu) 自武漢博士德公 司。步驟如下： ( 1 ) 切片脫蠟至蒸餾水； ( 2 ) 切片用 3H。 O z ( 現(xiàn)用現(xiàn)配) 室溫下反應(yīng) l Om i n ， 以便滅 活內(nèi)源性過氧化物酶 ； ( 3 ) 經(jīng)微波抗原修復(fù)后 ， 滴加正 常 山羊血清封 閉液 ， 室溫 2 0r ai n ； ( 4 ) 甩去 多余 的液 體

8、， 滴加 適 當(dāng)稀 釋 的一 抗 ( 兔抗 G A B A， 1： 1 0 0 ) ，4℃孵育過夜； ( 5 ) P B S洗 3次， 滴加生物素化二抗 ( 山羊抗兔 I g G ) ， 3 7℃反應(yīng) 2 0r a i n ； ( 6 )P B S洗 3次 ， 滴加 S A B C ， 3 7℃反應(yīng) 2 0mi n ； ( 7 ) P B S 洗 4 次，滴加 D A B顯 色 劑 ， 室 溫條 件 下 控 制 反 應(yīng) 時(shí) 間；( 8

9、) 脫水 ， 透明 ， 封 片。第 3套切片做 陰性對(duì) 照 ， 用 P B S 代替一抗 ， 其他步驟 同 S A B C法 。明視野顯微 鏡 中觀察 G A B A陽性神經(jīng)元在三黃雞小腦 中的分 布 ， 用 N i k o n 顯微鏡成像系統(tǒng)進(jìn)行顯微照像。1 ． 2 統(tǒng) 計(jì)分析 采用圖像分析系統(tǒng) HP I A S - 1 0 0 進(jìn)行分析， 每張 切片按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)截取 1 O 個(gè)視野 ， 測(cè)定免疫 陽性細(xì)胞的數(shù)量 ， 所得數(shù)據(jù)以平

10、均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ( X±S )表示 。收稿 F t 期 ： 2 0 0 9 — 1 2 — 2 3 ； 修 回 日 期 ： 2 0 1 0 — 0 3 — 0 5* 國(guó)家 自 然科學(xué)基金項(xiàng) 目( 3 0 4 7 1 2 4 9 ， 3 0 9 7 2 1 5 2 ) 和國(guó)家博 士點(diǎn)基金項(xiàng) 目( 2 0 0 8 0 5 0 4 0 0 2 3 ) 資助**通訊作者． E - ma i l ： k m p e n g @s

11、 o h u ． c o r n羅厚強(qiáng) ， 男 ， 1 9 8 4 年生， 碩士． 現(xiàn)在工作單位 ： 溫州科技職業(yè)學(xué)院． 研究方 向： 禽類 中樞神經(jīng)發(fā)育．E - r n a ~ 1 ： c h v i o l e t @t o m ． c o m第 5 期 羅厚強(qiáng) 等 ： G A B A免疫陽性神 經(jīng)元 在三黃雞小腦 內(nèi)的分布 5 9 93 討 論 3 ． 1 三黃雞 小腦 的細(xì) 胞構(gòu)筑 三黃雞小腦 的正 中矢狀切面為近似圓形 ，

12、 其分 層與文獻(xiàn)報(bào)道的烏雞[、 鴿子[] 和非洲鴕鳥[ 5 ] 的小 腦相 同， 由外向內(nèi)依次為分子層 、 蒲肯野細(xì)胞層和顆 粒層 。筆者通過觀察， 發(fā)現(xiàn)三黃雞的小腦 內(nèi)側(cè)核發(fā) 達(dá) ， 神經(jīng)元數(shù)量較多 ， 細(xì)胞體積較大， 細(xì)胞排列緊密，而烏雞 的小腦內(nèi)側(cè)核不太發(fā)達(dá) ， 神經(jīng)元數(shù)量較少 ， 細(xì) 胞排列松散 ， 表明三黃雞此核團(tuán)較發(fā)達(dá) ， 這與烏雞的 研究結(jié)果 。 ] 不一致 ， 三黃雞此核團(tuán)同其他 2 個(gè)核 團(tuán) 不易區(qū)分 ， 分界不 明

13、顯 ， 這與鴿子【 4 ] 、 非洲鴕鳥l _ 5 ] 的 研究結(jié)果一致 。從鴿子善于飛翔 的能力來看 ， 鴿小 腦調(diào)節(jié)軀體運(yùn)動(dòng)的能力明顯強(qiáng)于三黃雞和烏雞 。但 三黃雞的小腦中央核 比烏雞的發(fā)達(dá)是否表明三黃雞 的小腦在調(diào)節(jié)其運(yùn)動(dòng) 的能力 比烏雞強(qiáng)， 這還有待進(jìn) 一 步 的研 究 。3 ． 2 三黃雞 G A B A陽性神經(jīng)元在小腦 中分布 氨基 丁 酸 ( g a m ma — a mi n o b u t y r i ca c i d

14、 ， G A —B A ) 是一種非蛋 白質(zhì)組成的天然氨基酸 ， 廣泛分布 于動(dòng)植物體 內(nèi)。在動(dòng)物體內(nèi)， G A B A幾乎 只存在于 哺乳動(dòng)物、 甲殼類動(dòng)物 、 昆蟲和一些寄生蟲的神經(jīng)組 織中， 其 中腦組織 中的含量大約為每克組織 0 ． 1 ～ 0 ． 6m g ， 免疫學(xué)研究表 明， 其含量最 高的區(qū)域 為腦 中黑質(zhì) 。GAB A 是 目前 研 究 較 為 深 入 的 一 種 重 要 的抑制性神經(jīng)遞質(zhì) ， 參與多種代謝活動(dòng)， 具

15、有很高的生理活性 ， 介導(dǎo) 了 4 O以上 的抑制性 神經(jīng) 傳 導(dǎo)。1 9 5 0 年 R o b e r t 等l _ 6 ] 和 A w a p a r a 等_ 7 ] 在 鼠腦 內(nèi)發(fā)現(xiàn) 了 G A B A， 后來研究者又發(fā)現(xiàn) G A B A是在人腦能量 代謝過程中起重要作用 的活性氨基酸_ 8 ] 。因此無論 是哺乳動(dòng)物還是禽類 的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中， G A B A 都 是非常重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì) ， G A B A的作用主要 是

16、通過突觸后膜上的 G A B A受體結(jié)合 ， 引起突觸后 膜超極化而發(fā)生抑制性作用 的。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ， G A —B A免疫陽性神經(jīng)元不僅在小腦皮質(zhì) 的藍(lán)狀細(xì)胞 、蒲肯野細(xì)胞層及高爾基細(xì)胞 中有大量的表達(dá) ， 而且 還在小腦 內(nèi)側(cè)核也有大量的表達(dá) ， 這與其他學(xué)者對(duì) 鵪鶉l _ 9 ] 、 貓_ 1 ] 、 鼠[ 1 o - 1 1 3 的研究結(jié)果一致。小腦皮質(zhì)對(duì)腦其他部位的影響主要是通過蒲肯 野細(xì)胞的傳出作用來實(shí)現(xiàn) 的L 】。蒲肯野細(xì)

17、胞 是小 腦皮質(zhì)中唯一的傳 出纖維 ， 大多終止于中央核 ， 其軸 突還可投射到前庭外側(cè) 核[ ” ] 、 脊髓[ H ] ， 這充分表明小腦內(nèi)存在從蒲肯野細(xì)胞到小腦 中央核、 前庭 外側(cè) 核 、 脊髓的信息傳遞的通路 ， 這樣小腦皮質(zhì)直接調(diào)控 運(yùn)動(dòng)的多種精細(xì)功能 。有研究表 明， G A B A還可能 通過其受體來調(diào)節(jié)從蒲肯野細(xì)胞到小腦 中央核的信 息。小腦中央核 中的 G A B A受體參與了動(dòng)物的眨 眼動(dòng)作[ 1 5 ] ， G

18、A B A受體 參與了小腦皮 層蒲肯野 細(xì) 胞與小腦深部核團(tuán)之間的神經(jīng)傳遞 ， 因此 G A B A也 就成為小腦傳出通路中唯一的遞質(zhì) 。由于鴿子具有 飛翔的能力 ， 而三黃雞飛翔能力退化 ， 三黃雞的中央 核沒有鴿子發(fā)達(dá) ， 神經(jīng)元數(shù)量也較少 ， 這可能是鴿小 腦蒲肯野細(xì)胞對(duì)小腦中央核的抑制作用 比三黃雞要 強(qiáng) ， 筆者推測(cè)是鴿小腦蒲肯野細(xì)胞分泌較多的 G A —B A 的緣故。隨著對(duì)小腦 研究 的深入 ， 發(fā)現(xiàn)小腦還 參與非運(yùn)動(dòng)的活

19、動(dòng) ， 如攝食調(diào)節(jié)[ M ] 、 學(xué)習(xí)記憶【 1等 功 能 。采 用順行 和逆 行追 蹤及 電生理 的方 法研究 指 出， 小腦和下丘腦之間存在著廣泛的雙向聯(lián)系， 且小 腦向下丘腦的投射纖維主要起源于小腦深部核團(tuán)，終止于下丘腦的廣泛區(qū)域_ 1， 這是否意味著 G A B A也參與了攝食及學(xué)習(xí)記憶等活動(dòng)仍需進(jìn)一步的研究 來證實(shí) 。參 考 文 獻(xiàn) [ 1 1 張正亮 ， 張大銀 ， 申林 ， 等． 貓小腦皮質(zhì) G A B A能神經(jīng)元年齡相

20、關(guān)性變化[ J ] ． 動(dòng)物學(xué)雜志， 2 0 0 7 ， 4 2 ( 6 ) ： 3 4 — 4 0 ．[ 2 1V I N C E N Z OB ， L UI S AR ， D A N I E L AV， e ta 1 ． G A B Ai mm u n o —r e a c t i v i t yi nt h ehu ma nc e r e b e l l a rc o r t e x： al i g h ta n de l e c

21、 t r o nm i c r o s c o p i c a ls t u d y [ J ] ． T h eHi s t o c h e m i c a lJ o u r n a l ， 2 0 0 1 ， 3 3 ：5 3 7 — 5 4 3 ．[ 3 ] 陳文欽 ， 彭克美 ， 劉華珍， 等． 烏雞小腦 的解 剖學(xué)及神經(jīng)肽 Y神 經(jīng)元分 布的研究 [ J ] ． 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 ， 2 0 0 5 ， 2 6 ( 1 ) ： 5

22、1 — 5 4 ．[ 4 ] 陳文欽 ， 劉華珍 ， 羅冠中， 等． 神經(jīng)肽 Y免疫反應(yīng) 神經(jīng)元在鴿小 腦 中的定位一 S A B C法 研究 [ J ] ． 中國(guó)獸 醫(yī)學(xué) 報(bào) ， 2 0 0 6 ， 2 6 ( 2 ) ：1 8 0 — 1 8 3 ．I s ] 羅厚強(qiáng) ， 王艷紅 ， 石留紅 ， 等． 非洲 鴕鳥小腦 3 個(gè) 神經(jīng)核 團(tuán)的細(xì)胞構(gòu)筑[ c ] ／ ／ 中國(guó)畜牧獸 醫(yī)學(xué)會(huì)． 中國(guó)畜 牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)解剖學(xué)及 組織胚胎學(xué)第 十五

23、次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集． 楊凌 ： [ 出版者不詳] ，2 0 0 8： 3 3 — 3 7 ．[ 6 ] R O B E R T SE ， F R A N K E LSG a ma - a mi n oa c i di nb r a i n ： i t sf o r —ma t i o nf r o mg l u t a m i ca c i d [ J ] ． JB i o lC h e m， 1 9 5 0 ， 1 8 7 ： 5 5

24、 — 6 3 ．L 7 ]A WA P A R AJ ， L A N D U AAJ ， F R E S TR， e ta 1 ． F r e eg a m a —a mi n o b u t y r i ci nb r a i n [ J ] ． JB i o lC h e m， 1 9 5 0 ， 1 8 7 ： 3 5 — 3 9 ．[ 8 ] 郭 曉娜 ， 朱永義 ， 朱科 學(xué)． 生物體 內(nèi)氨基丁酸的研究 _ J ] ． 氨基

25、酸和生物資源 ， 2 0 0 3 ， 2 5 ( 2 ) ： 7 o 一 7 2 ．[ 9 ] 范海燕 ， 黃秀 明， 李東 風(fēng)． G A B A 能神經(jīng)元 在鵪鶉 腦 內(nèi)的分布 [ J ] ． 東北師范大學(xué)學(xué)報(bào) ： 自然科學(xué)版 ， 2 0 0 6 ， 2 9 ( 2 ) ： 2 1 7 — 2 1 9 ．L 1 0 ]c A R ME NM， G U A D AL U P EGA， IAU R ACB ， e ta 1 ． E x p