GABA能回路系統(tǒng)在DRG神經(jīng)元中的表達(dá).pdf

1、背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion,DRG）是機(jī)體的初級(jí)感覺神經(jīng)元，是傳入纖維介導(dǎo)的外周信號(hào)向脊髓及以上中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的第一站。并且，在很多的慢性疼痛的條件下，DRG對(duì)外周神經(jīng)過度興奮起著重要的作用。γ-氨基丁酸(GABA)作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其參與的痛覺的傳遞和調(diào)控成已為人們充分認(rèn)識(shí)。以往人們認(rèn)為，GABA抑制系統(tǒng)僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而外周神經(jīng)纖維或神經(jīng)節(jié)沒有GABA的來源。但研究證實(shí)，DRG神

2、經(jīng)元胞體中不但含有高表達(dá)的GABA受體，而且在培養(yǎng)或者急性分離的DRG神經(jīng)元胞體中檢測(cè)到非常大的GABAA Cl-電流。那么這些存在于DRG神經(jīng)元胞體的GABA受體是否只能轉(zhuǎn)運(yùn)到脊髓背角中樞突末梢才能接收那里的GABA信號(hào)而發(fā)揮痛覺傳遞的調(diào)節(jié)功能？在此，我們提出DRG上可能存在著一個(gè)完整的功能性局部GABA能循環(huán)理論。
　　雖然研究發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元上分布大量的GABA受體，然而DRG中組成GABA能傳遞的其他關(guān)鍵組分的表達(dá)并沒有充

3、分的文獻(xiàn)記載。本文將對(duì)GABA能回路的關(guān)鍵組分在DRG神經(jīng)元的表達(dá)與分布、DRG中GABA的釋放進(jìn)行充分的研究證明。并且通過制備神經(jīng)病理性疼痛模型坐骨神經(jīng)慢性擠壓損傷（chronic constriction sciatic nerve injure,CCI）和坐骨神經(jīng)切斷（sciatic nerve transaction,SNT）模型，觀察DRG神經(jīng)元上GABA能系統(tǒng)各組分分子mRNA在神經(jīng)痛的發(fā)生中的變化，為以后臨床治療慢性疼痛提

4、供新的途徑。
　　第一部分：背根神經(jīng)節(jié)GABA能回路組分的表達(dá)以及GABA釋放的研究
　　目的：
　?。?）確定DRG中谷氨酸脫羧酶（GAD）、GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體如囊泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體（VGAT）以及細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體（GAT1-3），以及各GABA受體亞型的表達(dá)。
　?。?）檢測(cè)急性分離的完整的大鼠DRG GABA的釋放，并探究其釋放機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR）技術(shù)；冰凍切片-免疫熒光技術(shù)

5、；高效液相色譜法（HPLC）。
　　結(jié)果：
　?。?）在大鼠DRG利用qPCR技術(shù)，我們檢測(cè)到了GABAA受體的多種α，β和γ亞基的mRNA表達(dá)，其中α1-3和γ2亞基表達(dá)特別高。在DRG中，我們也檢測(cè)到GAD67，GAT1-3以及VGAT的表達(dá)，雖然比脊髓表達(dá)要低。在GAT中，GAT1的表達(dá)最高。而DRG中并沒有檢測(cè)到GAD65的表達(dá)。
　?。?）在免疫熒光的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到GABAA受體的α1，α4和β2亞基蛋白

6、在大鼠DRG神經(jīng)元中有高水平免疫反應(yīng)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在許多不同大小的神經(jīng)元中，VGAT與GAT1都有表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)GAT1在膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)。
　?。?）在新鮮提取的完整大鼠DRG中，細(xì)胞外液高K+孵育DRG能刺激釋放大量的GABA；GAT1的抑制劑NO711(200μM)本身顯著地增加GABA的釋放，并且還能夠部分地降低高 K+引起的GABA的釋放；囊泡傳遞（VGAT）抑制劑ConA(0.5μM)以及破傷風(fēng)（10μg/ml）都

7、能幾乎完全抑制高K+誘導(dǎo)的GABA的釋放。
　　結(jié)論：
　　通過實(shí)時(shí)定量PCR，免疫熒光，高效液相色譜法驗(yàn)證了大鼠DRG存在GABA能回路，擁有生產(chǎn)、釋放、回收GABA的功能。囊泡以及非囊泡抑制劑對(duì)GABA釋放都有影響，說明在DRG中GABA也通過傳統(tǒng)的囊泡傳遞以及GAT1的逆轉(zhuǎn)運(yùn)這兩種機(jī)制釋放。
　　第二部分：GABA能回路關(guān)鍵組分mRNA表達(dá)水平在神經(jīng)損傷后的變化
　　目的：
　　在神經(jīng)損傷所致神經(jīng)病理

8、性疼痛條件下，觀察 GABA能回路的關(guān)鍵組分相應(yīng)mRNA表達(dá)的變化，探討DRG GABA回路參與疼痛發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法：
　　制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型CCI和SNT。應(yīng)用熱刺痛儀和Von Frey纖維刺痛針，測(cè)定大鼠熱痛、刺痛閾值。利用實(shí)時(shí)定量 PCR(qPCR)的方法檢測(cè)GABA能回路的關(guān)鍵組分mRNA在神經(jīng)損傷前后表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）實(shí)驗(yàn)組CCI和SNT與對(duì)照組Sham相比，術(shù)后1天

9、，兩組動(dòng)物的機(jī)械痛閾均開始顯著性下降，機(jī)械痛覺過敏一直持續(xù)至術(shù)后第14天（P＜0.05）；熱痛閾值只有CCI組有明顯的下降，持續(xù)至術(shù)后第14天（P＜0.05）。
　　（2）GABA能回路的關(guān)鍵組分相應(yīng)mRNA表達(dá)，在手術(shù)的第五天，CCI組α1，γ2，GAD67的表達(dá)下調(diào)，α2，α5，β1，GAT2的表達(dá)增加；SNT組α1，γ2的表達(dá)下調(diào)，α5，β1，β3，GAT2，GAT3的表達(dá)增加。在手術(shù)第十四天，CCI組α1，α2，β2，γ2

10、，γ3，GAT2，GAD67的表達(dá)下調(diào)，α5的表達(dá)增加；SNT組α1，α2，γ2，γ3，GAT1，GAT3，GAD67，B1，B2的表達(dá)下調(diào)。上述基因表達(dá)的上調(diào)或下降都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　成功建立CCI與SNT大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，并發(fā)現(xiàn)在兩模型組中DRG GABA能回路的多種分子的mRMA表達(dá)水平發(fā)生變化，其中以GABAA受體的α1，γ2的表達(dá)下調(diào)最為明顯。DRG GABA能回路可能在神經(jīng)病理