高糖環(huán)境下大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4和PKCε的表達(dá).pdf

1、背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)為感知機(jī)體內(nèi)外環(huán)境刺激的重要部位，對感覺信息起放大和精細(xì)微調(diào)作用。當(dāng)外周神經(jīng)受到損傷時(shí)，DRG神經(jīng)元產(chǎn)生自發(fā)性持續(xù)性異常放電，而異位放電則是痛覺異常的電生理學(xué)基礎(chǔ)。DRG處異位電活動(dòng)的發(fā)生與DRG神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度有密切相關(guān)性。瞬時(shí)感受器電位(transient receptor potential，TRP)離子通道受到傷害性刺激后引起Ca2+內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致痛覺異常

2、。瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體4(Transientreceptor potential vanilloid4，TRPV4)是TRP亞家族成員之一，對鈣的通透性較高，并且在感受傷害的DRG神經(jīng)元中高表達(dá)，可感受低滲刺激、機(jī)械刺激、溫度(＞27℃)、低pH等多種理化刺激而在神經(jīng)性疼痛中的作用越來越受到重視。目前持續(xù)高糖刺激對DRG神經(jīng)元內(nèi)TRPV4表達(dá)是否有影響尚未明確。
　　 蛋白激酶C(protein kinase C，P

3、KC)作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，與各種疼痛機(jī)制有著直接或間接的聯(lián)系。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)屬于PKC家族新型亞家族成員之一，為非鈣依賴而對佛波酯或二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)敏感的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。持續(xù)高糖刺激明顯增加細(xì)胞內(nèi)從頭合成DAG含量，但是高糖刺激是否引起PKCε表達(dá)上調(diào)，目前沒有明確的定論。PKC的激活可以引起TRPV4通道的敏化，進(jìn)而引起痛覺過

4、敏。PKCε參與疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)是否與TRPV4有關(guān)，目前尚無定論。PKC除了通過磷酸化下游底物參與疼痛信號(hào)傳導(dǎo)外還參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控，但持續(xù)高糖刺激下PKCε對TRPV4表達(dá)是否有調(diào)節(jié)作用，目前尚不明確。因此，本研究通過體外高糖培養(yǎng)DRG神經(jīng)元，模擬糖尿病環(huán)境，觀察持續(xù)高糖刺激對TRPV4、PKCε基因和蛋白表達(dá)的影響，明確高糖刺激下TRPV4的激活是否依賴PKCε的參與，進(jìn)而探討痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabeti

5、c neuropathy, PDN）發(fā)生發(fā)展可能的分子機(jī)制，為PDN治療及新的臨床用藥提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 采用原代培養(yǎng)的新生大鼠DRG神經(jīng)元。神經(jīng)元在正常糖環(huán)境下培養(yǎng)48 h后換含有不同濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時(shí)給予Enzastaurin處理。根據(jù)培養(yǎng)基含糖濃度的不同以及是否給予Enzastaurin，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元分為6組:空白對照組(C組，糖濃度為5.5 mM)、中糖組（M組，糖濃度為17.5

6、mM）、高糖組(H組，糖濃度為35.0 mM);C給藥組（C+E組，5.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin）、M給藥組(M+E組，17.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)、H給藥組(H+E組，35.0 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)。用不同濃度葡萄糖以及Enzastaurin處理神經(jīng)元48 h后檢測神經(jīng)元TRPV4和PKCε基因和蛋白的表達(dá):①用RT-PCR和Real-time

7、PCR分別對TRPV4和PKCε mRNA進(jìn)行定性定量分析;②用免疫熒光法定性定位分析TRPV4和PKCε蛋白表達(dá);③Western blotting檢測TRPV4和PKCε蛋白表達(dá)變化。
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4 mRNA的表達(dá)為了驗(yàn)證高糖環(huán)境下DRG神

8、經(jīng)元中是否有TRPV4 mRNA的表達(dá)，首先用RT-PCR進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)各組神經(jīng)元中均有TRPV4 mRNA表達(dá)，而且高糖環(huán)境下表達(dá)強(qiáng)度有一定的增強(qiáng)趨勢。所以為了確保定量的準(zhǔn)確性，用Real-timeqPCR定量分析大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4 mRNA的表達(dá)。Real-time qPCR結(jié)果顯示，與C組比較，M組TRPV4 mRNA表達(dá)明顯增高，為C組的2.28倍，差異有顯著性(P＜0.01);H組表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

9、05)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應(yīng)未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4mRNA表達(dá)均有不同程度降低，分別降低27.00％、44.74％和45.45％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε mRNA的表達(dá)用RT-PCR進(jìn)行定性分析，并用Real-time qPCR定量分析大鼠DRG神經(jīng)元中PKCεmRNA的表達(dá)。Real-time qPCR結(jié)果顯示，與C組

10、比較，M組PKCε mRNA表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);H組PKCε mRNA表達(dá)明顯增高，為C組的1.41倍，差異有顯著性(P＜0.01)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應(yīng)未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組PKCε mRNA表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3.大鼠DRG神經(jīng)元TRPV4蛋白表達(dá)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在C組DRG神經(jīng)元細(xì)胞核區(qū)域TRPV4蛋白表達(dá)相對較強(qiáng)，胞漿表達(dá)

11、相對微弱，然而在持續(xù)高糖刺激（M組、H組）下TRPV4蛋白具有在細(xì)胞核區(qū)域表達(dá)變?nèi)酢麧{表達(dá)變強(qiáng)的趨勢。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白在胞核區(qū)域表達(dá)相對較強(qiáng)，胞漿表達(dá)相對較弱。DRG神經(jīng)元熒光強(qiáng)度分析結(jié)果顯示，與C組比較， M組、H組TRPV4蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與相應(yīng)未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、（P＜0.05）。
　　 4.大鼠DRG神經(jīng)元PKCε蛋白表達(dá)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，C組和C+E組PKCε蛋白胞漿區(qū)域表達(dá)相對較強(qiáng)，胞核表達(dá)相對微弱;然而在M組、M+E組、H組、H+E組中胞漿、胞核表達(dá)具有明顯增強(qiáng)的趨勢，其中胞核表達(dá)增強(qiáng)趨勢最明顯。熒光強(qiáng)度分析結(jié)果顯示，與C組比較，M組、H組PKCε蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與相應(yīng)未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義（P＞0.05）。
　　 5.大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4蛋白的表達(dá)Western blot分析結(jié)果顯示，持續(xù)高糖刺激明顯增加DRG神經(jīng)元TRPV4蛋白的表達(dá)，與C組比較，M組和H組TRPV4蛋白表達(dá)增加顯著，分別為C組的5.72倍、12.98倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應(yīng)未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達(dá)均降低，分別降低22.22％、40.5

14、9％、41.28％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε蛋白的表達(dá)Western blot分析結(jié)果顯示，持續(xù)高糖刺激明顯增加DRG神經(jīng)元PKCε蛋白的表達(dá)，與C組比較，M組和H組PKCε蛋白表達(dá)增加顯著，分別為C組的1.11倍、1.98倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應(yīng)未給藥組相比，C+E組、M+E組、H+E組PKCε蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)