高糖環(huán)境下大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4和PKCε的表達.pdf

1、背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)為感知機體內(nèi)外環(huán)境刺激的重要部位，對感覺信息起放大和精細微調(diào)作用。當外周神經(jīng)受到損傷時，DRG神經(jīng)元產(chǎn)生自發(fā)性持續(xù)性異常放電，而異位放電則是痛覺異常的電生理學基礎。DRG處異位電活動的發(fā)生與DRG神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度有密切相關性。瞬時感受器電位(transient receptor potential，TRP)離子通道受到傷害性刺激后引起Ca2+內(nèi)流增加，從而導致痛覺異常

2、。瞬時感受器電位離子通道香草素受體4(Transientreceptor potential vanilloid4，TRPV4)是TRP亞家族成員之一，對鈣的通透性較高，并且在感受傷害的DRG神經(jīng)元中高表達，可感受低滲刺激、機械刺激、溫度(＞27℃)、低pH等多種理化刺激而在神經(jīng)性疼痛中的作用越來越受到重視。目前持續(xù)高糖刺激對DRG神經(jīng)元內(nèi)TRPV4表達是否有影響尚未明確。
　　 蛋白激酶C(protein kinase C，P

3、KC)作為重要的信號轉導分子，與各種疼痛機制有著直接或間接的聯(lián)系。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)屬于PKC家族新型亞家族成員之一，為非鈣依賴而對佛波酯或二?；视?diacylglycerol，DAG)敏感的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。持續(xù)高糖刺激明顯增加細胞內(nèi)從頭合成DAG含量，但是高糖刺激是否引起PKCε表達上調(diào)，目前沒有明確的定論。PKC的激活可以引起TRPV4通道的敏化，進而引起痛覺過

4、敏。PKCε參與疼痛信號的傳導是否與TRPV4有關，目前尚無定論。PKC除了通過磷酸化下游底物參與疼痛信號傳導外還參與細胞的轉錄及翻譯調(diào)控，但持續(xù)高糖刺激下PKCε對TRPV4表達是否有調(diào)節(jié)作用，目前尚不明確。因此，本研究通過體外高糖培養(yǎng)DRG神經(jīng)元，模擬糖尿病環(huán)境，觀察持續(xù)高糖刺激對TRPV4、PKCε基因和蛋白表達的影響，明確高糖刺激下TRPV4的激活是否依賴PKCε的參與，進而探討痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabeti

5、c neuropathy, PDN）發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，為PDN治療及新的臨床用藥提供理論與實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 采用原代培養(yǎng)的新生大鼠DRG神經(jīng)元。神經(jīng)元在正常糖環(huán)境下培養(yǎng)48 h后換含有不同濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時給予Enzastaurin處理。根據(jù)培養(yǎng)基含糖濃度的不同以及是否給予Enzastaurin，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元分為6組:空白對照組(C組，糖濃度為5.5 mM)、中糖組（M組，糖濃度為17.5

6、mM）、高糖組(H組，糖濃度為35.0 mM);C給藥組（C+E組，5.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin）、M給藥組(M+E組，17.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)、H給藥組(H+E組，35.0 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)。用不同濃度葡萄糖以及Enzastaurin處理神經(jīng)元48 h后檢測神經(jīng)元TRPV4和PKCε基因和蛋白的表達:①用RT-PCR和Real-time

7、PCR分別對TRPV4和PKCε mRNA進行定性定量分析;②用免疫熒光法定性定位分析TRPV4和PKCε蛋白表達;③Western blotting檢測TRPV4和PKCε蛋白表達變化。
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：
　　 1.大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4 mRNA的表達為了驗證高糖環(huán)境下DRG神

8、經(jīng)元中是否有TRPV4 mRNA的表達，首先用RT-PCR進行定性分析，發(fā)現(xiàn)各組神經(jīng)元中均有TRPV4 mRNA表達，而且高糖環(huán)境下表達強度有一定的增強趨勢。所以為了確保定量的準確性，用Real-timeqPCR定量分析大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4 mRNA的表達。Real-time qPCR結果顯示，與C組比較，M組TRPV4 mRNA表達明顯增高，為C組的2.28倍，差異有顯著性(P＜0.01);H組表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.

9、05)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4mRNA表達均有不同程度降低，分別降低27.00％、44.74％和45.45％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε mRNA的表達用RT-PCR進行定性分析，并用Real-time qPCR定量分析大鼠DRG神經(jīng)元中PKCεmRNA的表達。Real-time qPCR結果顯示，與C組

10、比較，M組PKCε mRNA表達沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);H組PKCε mRNA表達明顯增高，為C組的1.41倍，差異有顯著性(P＜0.01)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組PKCε mRNA表達差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 3.大鼠DRG神經(jīng)元TRPV4蛋白表達細胞免疫熒光結果顯示，在C組DRG神經(jīng)元細胞核區(qū)域TRPV4蛋白表達相對較強，胞漿表達

11、相對微弱，然而在持續(xù)高糖刺激（M組、H組）下TRPV4蛋白具有在細胞核區(qū)域表達變?nèi)酢麧{表達變強的趨勢。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白在胞核區(qū)域表達相對較強，胞漿表達相對較弱。DRG神經(jīng)元熒光強度分析結果顯示，與C組比較， M組、H組TRPV4蛋白表達增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與相應未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義

12、（P＜0.05）。
　　 4.大鼠DRG神經(jīng)元PKCε蛋白表達細胞免疫熒光結果顯示，C組和C+E組PKCε蛋白胞漿區(qū)域表達相對較強，胞核表達相對微弱;然而在M組、M+E組、H組、H+E組中胞漿、胞核表達具有明顯增強的趨勢，其中胞核表達增強趨勢最明顯。熒光強度分析結果顯示，與C組比較，M組、H組PKCε蛋白表達增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與相應未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達差異沒有統(tǒng)計學意

13、義（P＞0.05）。
　　 5.大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV4蛋白的表達Western blot分析結果顯示，持續(xù)高糖刺激明顯增加DRG神經(jīng)元TRPV4蛋白的表達，與C組比較，M組和H組TRPV4蛋白表達增加顯著，分別為C組的5.72倍、12.98倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應未給藥組比較，C+E組、M+E組、H+E組TRPV4蛋白表達均降低，分別降低22.22％、40.5

14、9％、41.28％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6.大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε蛋白的表達Western blot分析結果顯示，持續(xù)高糖刺激明顯增加DRG神經(jīng)元PKCε蛋白的表達，與C組比較，M組和H組PKCε蛋白表達增加顯著，分別為C組的1.11倍、1.98倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用Enzastaurin處理DRG神經(jīng)元后，與相應未給藥組相比，C+E組、M+E組、H+E組PKCε蛋白表達差異沒有統(tǒng)計學