激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用及其分子機制研究.pdf

1、背景：瞬時感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型(transient receptor potentialvanilloid4，TRPV4)是瞬時感受器電位受體家族成員之一。該受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在海馬、大腦皮層、丘腦、小腦等腦區(qū)均有較多表達。TRPV4受體是一種“多覺型”受體，可以被多種因素如細胞水腫、溫熱刺激、花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物等激活，該受體激活后引起以鈣離子為主的陽離子內(nèi)流，導致細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高。資料報道，給予TRP

2、V4受體激動劑可以劑量依賴性地引起視網(wǎng)膜節(jié)細胞死亡，并介導次聲所致的神經(jīng)元損傷。但是TRPV4受體引起細胞死亡的機制目前尚不清楚。腦缺血時由于能量代謝障礙可以導致細胞毒性水腫和細胞膜脂質(zhì)代謝障礙，而這些病理改變均可以激活TRPV4受體。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注過程中，TRPV4受體蛋白表達增加，給予TRPV4受體阻斷劑可以明顯減少腦梗死體積。離體實驗也證明阻斷TRPV4受體可以減輕氧化應激對海馬星形膠質(zhì)細胞的損傷，對氧糖剝奪導致

3、的海馬CA1神經(jīng)元損傷也具有保護作用。以上報導提示TRPV4受體是介導缺血性腦損傷的一個重要靶點。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號通路是控制細胞的增殖、分化、存活和死亡的重要胞內(nèi)信號通路之一;而磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路是一個經(jīng)典的

4、抗凋亡、促進細胞存活的信號轉導通路。腦缺血時，MAPK信號通路被過度激活，而Akt信號通路被抑制是介導神經(jīng)損傷的重要原因。在培養(yǎng)的脂肪細胞上，TRPV4受體激動劑可以增加細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK(extracellular regulated protein kinases，ERK)和C-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase，JNK)的磷酸化水平。在血管內(nèi)皮細胞上，激活TRPV4受體后可以激活PI

5、3K。在多囊腎大鼠的膽管上皮細胞上，給予TRPV4受體激動劑可以增加Akt磷酸化水平，降低ERK磷酸化水平。以上資料提示激活TRPV4受體可以調(diào)節(jié)MAPK和PI3K/Akt信號通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)給予TRPV4激動劑對N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)介導的電流具有增強作用，提示激活TRPV4受體可以增強NMDA受體的功能。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：激活TRPV4受體對海馬

6、神經(jīng)元存活的作用及其機制。
　　目的：⑴明確激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用及其機制。⑵闡明TRPV4受體介導缺血性腦損傷的機制。
　　方法：①制備激活TRPV4受體的在體模型:側腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動劑GSK1016790A，制備激活TRPV4受體的在體模型。②組織化學染色:腦組織固定后石蠟包埋切片，用甲苯胺藍染色觀察GSK1016790A對海馬CA1和CA2/3區(qū)神經(jīng)元存活的作用。③蛋白印跡(W

7、estern blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標蛋白表達的作用。
　　結果：⑴側腦室注射GSK1016790A在（0.1～5μM/小鼠）濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性地導致海馬CA1區(qū)和CA2/3區(qū)神經(jīng)元死亡。⑵給予GSK1016790A能增加NMDA受體NR2B亞基磷酸化水平。⑶給予GSK1016790A能增加ERK的磷酸化(phosphorylation of ERK，p-ERK)水平，并降低Akt的磷酸化(phos

8、phorylation of Akt，p-Akt)水平;給予NR2B亞基受體的阻斷劑Ro25-6981能有效阻斷GSK1016790A對p-ERK和p-Akt的調(diào)節(jié)作用。⑷給予NR2B的阻斷劑Ro25-6981或PI3K的激動劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的神經(jīng)毒性作用，但是給予MAPK激酶(mitogen-activatedprotein kinase/ERK kinase，MEK)的阻斷劑U0126不能阻斷GSK1

9、016790A所致的神經(jīng)毒性作用。
　　結論：激活TRPV4受體通過磷酸化NMDA受體的NR2B亞基，下調(diào)Akt信號通路，進而導致神經(jīng)損傷作用。
　　第二部分：TRPV4受體介導缺血性腦損傷的機制。
　　方法：⑴腦缺血再灌注模型制備:運用血管內(nèi)線栓法阻塞右側大腦中動脈60 min，制備大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的小鼠模型。⑵腦梗死體積測定:MCAO再灌注

10、后24 h和48 h的腦片置于氯化三苯基四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）溶液中反應，正常腦組織呈紅色，而梗死組織呈白色，白色腦組織體積即為MCAO后腦梗死體積。⑶Hoechst染色:MCAO再灌注48 h的腦片進行Hoechst染色以觀察海馬神經(jīng)元的凋亡。⑷蛋白印跡(Western blot):檢測MCAO再灌注不同時間點海馬組織目標蛋白表達水平。
　　結果：①腦缺血再灌注1～24 h內(nèi)p-ERK蛋白水平

11、增高，p-ERK蛋白增加程度隨著再灌注時間的延長逐漸下降。②腦缺血再灌注1～24 h內(nèi)p-Akt蛋白水平在再灌注1～4 h內(nèi)增加，隨著再灌注時間的延長，p-Akt水平明顯下降。③側腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047（10μM/鼠）能有效減小MCAO再灌注24 h和48 h腦梗死體積，并能有效降低p-ERK蛋白水平、增加p-Akt蛋白水平。④側腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047（10μM/鼠）能有效抑制MCAO再灌

12、注48 h海馬CA1區(qū)的細胞凋亡，提高Bcl-2/Bax蛋白比值，抑制caspse-3剪切體蛋白水平。⑤側腦室注射TRPV4受體激動劑GSK1016790A能降低Bcl-2/Bax蛋白比值，增加caspse-3剪切體蛋白水平，給予PI3K激動劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。
　　結論：綜合本課題實驗結果和課題組前期的研究，在腦缺血時，TRPV4受體被過度激活，通過增強NMDA受體NR2B亞基的功能下調(diào)A