甘草甜素對(duì)幼鼠顳葉癲癇海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　癲癇是兒童時(shí)期常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，70-80％的癲癇患者通過(guò)抗癲癇藥物的治療能控制癲癇的發(fā)作，但仍有20-30%左右的癲癇患者在接受規(guī)范合理的抗癲癇藥物治療后依然有發(fā)作而成為難治性癲癇。顳葉癲癇在難治癲癇中最常見(jiàn)，一直以來(lái)都是癲癇治療的難點(diǎn)。大量研究表明，顳葉癲癇的反復(fù)發(fā)作可致海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失及海馬硬化，這不僅對(duì)病人的生活、工作產(chǎn)生巨大的影響，也給患者的家庭和社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)。目前的抗癲癇藥物主要作用于

2、離子通道，抑制神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)行對(duì)癥治療。深入研究癲癇的病因和發(fā)病機(jī)制，針對(duì)發(fā)作機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)新藥物、尋求新的治療途徑，是癲癇治療未來(lái)發(fā)展的方向。
　　近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明:癲癇與炎癥密切相關(guān)，高遷移率族蛋白1（High mobility group protein1，HMGB1）是一種重要的細(xì)胞炎癥因子，正常情況下主要存在于細(xì)胞核中，參與維持核小體的結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，當(dāng)發(fā)生組織損傷時(shí)迅速?gòu)膿p傷的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞

3、和星形膠質(zhì)釋放到細(xì)胞外、腦脊液及血清中，它的釋放是觸發(fā)免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)信號(hào)，在膿毒癥、關(guān)節(jié)炎等多疾病中具有重要的作用，最新研究發(fā)現(xiàn)其與癲癇的發(fā)生也有著緊密的聯(lián)系。Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）是一種識(shí)別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的受體，能識(shí)別損傷或應(yīng)激所致的“內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)”如：HMGB1，激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（

4、Nuclear factor-k-gene binding，NF-κB）發(fā)生磷酸化，磷酸化的NF-κB（Phosphorylated Nuclear factor-k-gene binding，p-NF-κB）進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)促炎因子基因表達(dá)，腦內(nèi)炎癥導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作。而甘草類藥物有較好的抗炎、抗過(guò)敏和細(xì)胞膜保護(hù)作用，并且有較高的安全性和耐受性，臨床上已廣泛用來(lái)治療肝炎、皮膚病等，最近國(guó)內(nèi)外有研究表明甘草甜素（Glycyrrhizin，

5、GL）作為HMGB1的小分子抑制劑，在炎癥抑制方面有一定作用，并且有較好的安全性和耐受性，且部分藥物可穿過(guò)血腦屏障，有望成為抗癲癇藥物的候選者，但關(guān)于甘草類藥物的神經(jīng)元保護(hù)及抗癲癇作用的機(jī)制，目前還缺乏臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。
　　本研究在用海人酸（Kainic acid，KA）誘導(dǎo)建立幼鼠顳葉癲癇模型的基礎(chǔ)上，采用甘草甜素（Glycyrrhizin，GL）預(yù)處理，通過(guò)觀察行為學(xué)表現(xiàn)，探討甘草甜素對(duì)海人酸誘導(dǎo)幼鼠癲癇發(fā)作的敏感性及嚴(yán)

6、重性的影響，利用Western blot與Q-RT-PCR分別從蛋白質(zhì)與mRNA水平檢測(cè)海馬組織HMGB1/TLR4/p-NF-κB的表達(dá)，運(yùn)用HE染色及免疫組化從細(xì)胞凋亡水平觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失情況，探討甘草甜素可能的抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，及其與腦內(nèi)免疫炎性反應(yīng)的關(guān)系，有望老藥新用，找到癲癇治療的新方向并為其提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　出生21天的SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組。模型Ⅰ組用KA誘導(dǎo)

7、癲癇發(fā)作，模型Ⅱ組在應(yīng)用KA前30min腹腔注射GL，模型Ⅰ組根據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)不同分為3h、12h、24h、7d四個(gè)亞組，模型Ⅱ組根據(jù)GL不同劑量分為10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只動(dòng)物，行為學(xué)表現(xiàn)按照Racine評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)分，RT-PCR檢測(cè)急性期（3h、12h、24h）海馬區(qū)HMGB1/TLR-4 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白的表達(dá)，E

8、lisa檢測(cè)血清中HMGB1蛋白的表達(dá)變化，免疫組化檢測(cè)慢性期（7d）海馬神經(jīng)元抗核抗體（Neu-N）的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)結(jié)果：模型Ⅰ組SE發(fā)生率為75%，死亡4只，存活率為：67.3%， SOT:24.08±1.98min；模型Ⅱ組SE發(fā)生率為64.3%，總共死亡6只，存活率85.7%，SOT:33.39±2.66min；生理鹽水對(duì)照組大鼠均未死亡，存活率為100%；GL預(yù)處理模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較，SE發(fā)

9、生率降低，存活率增高，SOT時(shí)間延長(zhǎng)。
　　2.癲癇急性期海馬區(qū) HMGB1/TLR-4基因表達(dá)結(jié)果：模型Ⅰ組與對(duì)照組比較，隨著觀察時(shí)間（3h、12h、24h）的延長(zhǎng)，HMGB1、TLR-4基因表達(dá)升高,其中12h時(shí)達(dá)到峰值（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），12h時(shí)間點(diǎn)，其中模型Ⅱ組HMGB1、TLR-4基因表達(dá)量較模型Ⅰ組顯著降低（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05）,不同劑量的干預(yù)的模型Ⅱ組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。<

10、br>　　3.癲癇急性期海馬區(qū)HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果：模型Ⅰ組與對(duì)照組比較，隨著觀察時(shí)間（3h、12h、24h）的延長(zhǎng)，TLR-4、p-NF-kB蛋白表達(dá)升高,其中12h時(shí)達(dá)到峰值（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），HMGB1的蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。在12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，模型Ⅱ組TLR-4、p-NF-kB蛋白表達(dá)量較模型Ⅰ組顯著降低（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），不同劑量的干預(yù)的模型Ⅱ組

11、之間差異不大（P＞0.05）。
　　4.癲癇急性期血清中HMGB1表達(dá)結(jié)果：模型Ⅰ組與對(duì)照組比較，血清中HMGB1濃度增高，其中12h時(shí)明顯（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），在12h的時(shí)間點(diǎn)，模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較，血清中 HMGB1的濃度顯著降低（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），不同劑量的干預(yù)的模型Ⅱ組之間差異不大（P＞0.05）。
　　5.慢性期海馬區(qū)Neu-N表達(dá)結(jié)果：模型Ⅰ組與對(duì)照組比較，海馬區(qū)神經(jīng)元顯著丟失

12、（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較,海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失顯著減少（差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），不同劑量的干預(yù)的模型Ⅱ組之間差異不大（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.GL預(yù)處理可以延長(zhǎng)幼鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，降低癲癇發(fā)作的易感性，減輕幼鼠癲癇的發(fā)作。
　　2.幼鼠癲癇急性期海馬HMGB1/TLR-4基因表達(dá)增加，TLR-4的蛋白表達(dá)增高，誘導(dǎo)NF-κB的磷酸化。
　　3.GL預(yù)處