神經(jīng)元活性對TrkB受體再循環(huán)的調節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對于調控活性依賴的突觸結構和功能起著至關重要的作用。BDNF與TrkB受體結合后,激活TrkB受體自身的酪氨酸激酶活性,繼而激活下游磷脂酶Cy (PLCy)、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)和細胞外信號調節(jié)激酶(Erk)等一系列胞內(nèi)重要的信號轉導通路,介導其生物學效應。BDNF在調節(jié)突觸的可塑性過程中起關鍵作用,通過激活TrkB受體,其能加強早期和晚期的LTP。全長型TrkB受體(TrkB-FL)和一種截短

2、型TrkB異構體-TrkB.T1在結合BDNF后進入不同的內(nèi)吞后分選途徑：TrkB.T1進入默認(default)的再循環(huán)途徑,而TrkB-FL的分選則基于一種依賴內(nèi)涵體相關蛋白HRS的特殊的調節(jié)機制,并且這種調控同時依賴于TrkB自身的激酶活性,提示TrkB的內(nèi)吞后的命運存在精密的調控機制。為了研究神經(jīng)元活性對TrkB受體再循環(huán)的影響,我們設計了膜表面生物素檢測受體降解及免疫熒光定量分析受體再循環(huán)等實驗,分析了神經(jīng)元活性對TrKB受體

3、再循環(huán)的作用及其對神經(jīng)元生物學功能的影響。研究結果如下：1.神經(jīng)元活性抑制BDNF誘導的TrkB-FL受體向降解途徑的分選在基礎狀態(tài)下,BDNF刺激可以導致膜表面TrkB-FL量在一個小時內(nèi)迅速下降,而在Gly誘導的cLTP模型中,TrkB-FL的的含量無明顯下降,這一過程并非由TrkB轉錄增加所引起,而是膜表面TrkB的降解減少導致。2. cLTP促進TrkB-FL的再循環(huán)而不影響TrkB.T1的再循環(huán)通過可裂解生物素實驗和免疫熒光定

4、量分析進一步證明：活性條件下,TrkB-FL降解的減少是由于更多的TrkB-FL內(nèi)吞后進入再循環(huán)途徑回到細胞膜上,而TrkB.T1不受神經(jīng)元活性的影響。3. TrkB酪氨酸激酶區(qū)對其活性依賴的再循環(huán)至關重要我們構建了缺失TrkB不同區(qū)域的突變體：△CT(缺失C末端),ΔTK(缺失酪氨酸激酶區(qū)和C末端)和KD,通過免疫熒光定量分析實驗證明TrkB△CT的再循環(huán)是活性依賴性的,TrkB△TK的再循環(huán)則不受活性調控。4. TrkB-FL和Tr

5、kB.T1分別由Rab11和Rab4介導的再循環(huán)首先通過免疫共沉淀實驗證實Rab11能夠與TrkB-FL結合,并且GDP結合形式的Rab11競爭性的結合TrkB, TrkB.T1不能與Rab11結合。然后通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)cLTP促進再循環(huán)的TrkB-FL與Rab11的共定位。構建Rab11S25N, Rab4S22N質粒模擬失活型的Rab11和Rab4,通過免疫熒光定量分析及膜表面生物素實驗證實TrkB-FL和TrkB.T1的再循環(huán)

6、分別由Rab11和Rab4介導。5. cLTP狀態(tài)下增加的再循環(huán)促進BDNF激活TrkB下游信號轉導cLTP刺激顯著增強1h時間點BDNF誘導的ERK及AKT信號通路。而轉染Rab11siRNA的神經(jīng)元其ERK, AKT磷酸化水平降低。此外,Rab11的敲除會消除cLTP刺激后BDNF誘導的TrkB下游信號增強。6. cLTP狀態(tài)促使TrkB再循環(huán)囊泡向樹突棘處轉運免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BDNF刺激后樹突棘頭部處TrkB增多。進一步的實驗將再

7、循環(huán)的TrkB與PSD95染色,結果顯示活性狀態(tài)下再循環(huán)的TrkB-FL與PSD95的共定位增多,失活型的Rab11抑制這種共定位。7.激活型的Rab11調控TrkB和PSD95間的相互作用通過免疫共沉淀實驗證明改變Rab11的活性,可以影響TrkB進入突觸后與PSD95的結合能力,其中持續(xù)激活形式的Rab11突變體Rab11Q70L增強TrkB/PSD95的結合。Rab11與PSD95間也有相互作用,只有Rab11Q70L可以與PSD