CPE參與調(diào)控海馬神經(jīng)元活性依賴性TrkB受體胞內(nèi)運(yùn)輸.pdf

1、一、研究背景:
　　 神經(jīng)元突觸可塑性不僅在發(fā)育期對神經(jīng)環(huán)路的建立起重要作用，而且在成年期參與控制腦的認(rèn)知功能和復(fù)雜行為。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)不僅能促進(jìn)神經(jīng)元的存活、分化以及樹突、軸突的生長，而且在調(diào)節(jié)突觸的可塑性方面也起到關(guān)鍵作用。大量研究已表明BDNF對神經(jīng)元突觸的調(diào)控，受神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)，BDNF優(yōu)先作用于有活性的神經(jīng)元或突觸。
　　 BDNF的功能受體主要有兩類：p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體和TrkB酩氨酸激酶

2、受體，其中，TrkB是其的高親和力受體，而且是介導(dǎo)BDNF功能發(fā)揮的關(guān)鍵分子。因此，神經(jīng)元表面TrkB受體的水平對于BDNF功能的發(fā)揮具有重要作用。大量研究顯示活性刺激能促進(jìn)神經(jīng)元膜表面TrkB受體水平的顯著升高，例如高K+刺激，高頻電刺激及Glycine(化學(xué)性LTP誘導(dǎo)劑)作用等。這在一定程度上解釋了BDNF對神經(jīng)元的作用受神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)，因?yàn)楦呋钚缘纳窠?jīng)元膜表面的TrkB受體含量較高，更容易接受來自BDNF的信號。但神經(jīng)元活性促

3、進(jìn)膜表面TrkB受體含量增加的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚不十分清楚。TrkB受體的胞內(nèi)域是調(diào)控其運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵區(qū)域，于是用TrkB受體胞內(nèi)域?yàn)檎T餌進(jìn)行酵母雙雜交，釣取有可能與TrkB結(jié)合并調(diào)控其活性依賴性胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的分子-CPE。CPE分子存在兩種形式：游離型和膜結(jié)合型。游離型CPE主要發(fā)揮羧肽酶的功能；而膜結(jié)合型CPE是一種既可以參與調(diào)節(jié)性分選，介導(dǎo)POMC，胰島素等進(jìn)入調(diào)節(jié)性運(yùn)輸途徑，也可以作為中間分子介導(dǎo)調(diào)節(jié)性囊泡的運(yùn)輸?shù)鹊亩喙δ芊肿?。那么，CP

4、E與TrkB的這種結(jié)合，是否對TrkB受體的活性依賴的調(diào)節(jié)性胞內(nèi)運(yùn)輸過程有功能意義呢？
　　 二、研究目的:
　　 本研究旨在證實(shí)CPE能調(diào)控TrkB受體神經(jīng)元活性依賴的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而有助于我們進(jìn)一步探究神經(jīng)元活性促進(jìn)TrkB受體膜表面水平升高的機(jī)制，并由此為臨床BDNF所介導(dǎo)的精神疾病及學(xué)習(xí)記憶功能等提供參考。
　　 三、研究方法:
　　 1.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。免疫共沉淀技術(shù)，是以抗體和抗原之間的專一性作

5、用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。在293細(xì)胞中過表達(dá)相應(yīng)的各種CPE或TrkB的突變體。裂解細(xì)胞收集上清，根據(jù)特異識別不同分子的相應(yīng)抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠子進(jìn)行免疫沉淀，那么與之結(jié)合的分子也會共沉淀下來，之后用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測。通過此方法可以確定CPE與TrkB的結(jié)合及具體結(jié)合區(qū)域。
　　 2.免疫熒光實(shí)驗(yàn)。免疫熒光即根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原。我們利用該技術(shù)對外源過表達(dá)的C

6、PE與TrkB在海馬神經(jīng)元的定位情況進(jìn)行熒光標(biāo)記，并通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察記錄。利用該技術(shù)，檢測干擾CPE的表達(dá)后，Glycine活性刺激對TrkB在樹突棘及對應(yīng)樹突干的相對分布是否有影響。免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測干擾CPE表達(dá)對BDNF-TrkB所介導(dǎo)的樹突棘生長及形態(tài)可塑性的影響。
　　 3.全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡技術(shù)。TIRF顯微鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面附近分子的動態(tài)觀察。在海馬神經(jīng)元中共轉(zhuǎn)染CPE-RFP和Trk

7、B-GFP兩種質(zhì)粒。在活細(xì)胞狀態(tài)下，分別在Glycine刺激前后，觀察拍照，記錄CPE-RFP和TrkB-GFP的在膜表面附近的共定位的點(diǎn)的運(yùn)動情況。
　　 4.Western Blot實(shí)驗(yàn)。Western Blot是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。本研究中用于檢測一系列免疫共沉淀結(jié)果，膜表面生物素結(jié)果及CPE對活性條件下的BD

8、NF-TrkB介導(dǎo)的下游信號通路功能的影響的結(jié)果。
　　 5.膜表面生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。用生物素標(biāo)記細(xì)胞膜表面的蛋白，收集細(xì)胞裂解液，然后用與生物素有高親和力的親和素分離膜表面蛋白，最后用Westernblot技術(shù)及相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測。在海馬神經(jīng)元中干擾內(nèi)源CPE的表達(dá)，研究CPE對神經(jīng)元中內(nèi)源TrkB活性依賴的上膜的影響。
　　 6.免疫熒光染色定量分析法。將TrkB及其突變體的N端融合Flag標(biāo)簽，C端融合GFP綠色熒光

9、蛋白。參照趙玲老師已發(fā)表的文章中已建立的膜表面熒光定量分析法，在神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，在非透化情況下，用594熒光素標(biāo)記Flag，代表的是膜表面的TrkB或其突變體結(jié)構(gòu)；GFP綠色熒光顯示的是總的TrkB或其突變體結(jié)構(gòu)，再將紅綠熒光比值通過已知的比率換算，即可得出膜表面TrkB或其突變體的分布比例情況。如果同時(shí)共轉(zhuǎn)CPEsiRNA或CPE DN質(zhì)粒等，即可檢測它們對TrkB受體的活性上膜過程的影響。
　　

10、 四、研究結(jié)果:
　　 前期山東大學(xué)神經(jīng)生物研究所趙玲老師的研究結(jié)果中已通過免疫共沉淀及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CPE與TrkB受體的結(jié)合與在海馬神經(jīng)元中的共定位；同時(shí)，通過干擾的CPE表達(dá)，利用膜表面免疫熒光定量分析法，證實(shí)CPE分子確實(shí)能影響TrkB受體神經(jīng)元活性依賴的上膜。這里我們又通過另外的實(shí)驗(yàn)對這一結(jié)果進(jìn)行了豐富并進(jìn)一步開展了相關(guān)機(jī)制和功能實(shí)驗(yàn)，如下：
　　 1.CPE調(diào)節(jié)內(nèi)源性TrkB受體活性依賴的上膜。

11、　　 前面已知，CPE能影響海馬神經(jīng)元中外源過表達(dá)Flag-TrkB的活性依賴的上膜。這里，我們通過膜表面生物素化的方法，研究CPE對海馬神經(jīng)元中內(nèi)源TrkB受體的活性依賴的上膜的調(diào)控。通過膜表面蛋白分子的生物素標(biāo)記，親和素對生物素結(jié)合蛋白的分離，在Western Blot的蛋白檢測結(jié)果中，我們得出，活性刺激能促進(jìn)內(nèi)源TrkB的上膜，但當(dāng)干擾CPE的表達(dá)后，這種作用消失。因此，CPE在生理水平上，對內(nèi)源性TrkB受體活性依賴的上膜也有

12、調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步證實(shí)了CPE對TrkB受體活性依賴的上膜的重要性。
　　 2.CPE與TrkB活性依賴的膜表面附近的共運(yùn)動。
　　 海馬神經(jīng)元中共轉(zhuǎn)染CPE-RFP和TrkB-GFP兩種質(zhì)粒，分別在Glycine刺激前后，觀察拍照，記錄CPE-RFP和TrkB-GFP囊泡由活性刺激引起的在膜附近的運(yùn)動情況。通過結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，Glycine刺激能促進(jìn)膜表面附近CPE-RFP與TrkB-GFP共定位點(diǎn)的增多。因此，這個(gè)結(jié)果

13、說明，Glycine活性刺激不僅能促進(jìn)TrkB向膜表面附近的運(yùn)動，也能促進(jìn)CPE向近膜的分布，表明CPE可能在TrkB向膜表面附近運(yùn)動過程中發(fā)揮作用。
　　 3.CPE促進(jìn)活性依賴的TrkB從樹突干向?qū)?yīng)樹突棘的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 樹突棘是形成興奮性突觸的關(guān)鍵部位，因此TrkB向樹突棘的分布能一定程度的反映CPE能促進(jìn)TrkB活性依賴的功能發(fā)揮。通過在海馬神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染CPE siRNA，降低CPE的表達(dá)，再進(jìn)行免疫熒光染色。通

14、過統(tǒng)計(jì)分析，我們得出，在對照組，加入Glycine后能顯著促進(jìn)TrkB的膜表面分布，但干擾CPE表達(dá)組抑制了這種增加。因此，此結(jié)果證明，CPE有助于Glycine刺激所引起的TrkB從樹突干向樹突棘的運(yùn)動。
　　 4.TrkB受體近膜(JM)區(qū)的BOX2域是介導(dǎo)它與CPE結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 首先我們構(gòu)建了缺失TrkB胞內(nèi)域不同區(qū)域的缺失突變體，然后通過一系列免疫共沉淀和Western Blot的方法檢測它們的結(jié)合情況

15、，想通過區(qū)域缺失的方法來逐步明確介導(dǎo)它們之間結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。我們分別構(gòu)建了缺失胞外域的CPE(CPEC25)和TrkB(TrkB△EX)，以及在此基礎(chǔ)上又進(jìn)一步的分別缺失TrkB胞內(nèi)域的JM區(qū)、TK區(qū)和CT區(qū)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們確定JM區(qū)是介導(dǎo)它與CPEC25結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。進(jìn)一步為了細(xì)化JM區(qū)的具體哪個(gè)區(qū)域介導(dǎo)它與CPEC25的結(jié)合，我們又構(gòu)建了缺失JM區(qū)不同“BOX”域(△EXTrkB△BOX1/2/3)的突變體。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們

16、知道JM區(qū)的BOX2域是介導(dǎo)它與CPEC25結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 5.TrkB的JM區(qū)BOX2域?qū)τ赥rkB受體的活性依賴性上膜過程是充分必要的。
　　 根據(jù)TrkB受體膜表面免疫熒光定量分析法，在海馬神經(jīng)元中分別過表達(dá)缺失JM區(qū)不同BOX域的Flag-TrkB△BOX1/2/3-GFP突變體，然后進(jìn)行免疫熒光染色。通過結(jié)果統(tǒng)計(jì)，我們可以看出JM區(qū)的BOX2域是TrkB受體的活性上膜過程的必需結(jié)構(gòu)。
　　 同樣

17、根據(jù)TrkB受體膜表面免疫熒光定量分析法，在海馬神經(jīng)元中分別過表達(dá)嫁接不同BOX域的Flag-T1+BOX1/2/3-GFP突變體，然后進(jìn)行免疫熒光染色。通過結(jié)果統(tǒng)計(jì)，我們可以得出JM區(qū)的BOX2域能賦予T1活性依賴的上膜功能，因此JM區(qū)的BOX2域?qū)τ赥rkB受體的活性上膜過程是充分的。
　　 6.CPE的第462-466個(gè)氨基酸是介導(dǎo)它與TrkB結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 首先我們構(gòu)建了缺失CPEC25 C末端不同區(qū)域的

18、突變體(CPEC25△4，CPEC25△6，CPEC25△10，CPEC25△15)，同樣通過免疫共沉淀和Western
　　 Blot的方法檢測它們與的TrkB△EX結(jié)合情況。通過本實(shí)驗(yàn)，我們確定了CPE的第462-466個(gè)aa是介導(dǎo)CPEC25與TrkB△EX結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 7.CPE調(diào)控活性條件下BDNF-TrkB介導(dǎo)的下游信號。
　　 既然我們推測，CPE能影響神經(jīng)元活性依賴的TrkB膜表面水平，

19、接下來我們想檢測CPE對BDNF所介導(dǎo)的下游信號通路功能影響。收取轉(zhuǎn)染了CPE
　　 siRNA或ctr siRNA的海馬神經(jīng)元蛋白裂解液，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)，然后分別用對應(yīng)的抗體檢測。通過檢測磷酸化水平的TrkB，下游的Erk1/2和AKT信號分子，我們發(fā)現(xiàn)Glycine刺激能夠明顯的促進(jìn)TrkB及其信號通路下游分子的活性水平增加，但干擾了CPE表達(dá)后，這種現(xiàn)象受到抑制。此結(jié)果表明，CPE確實(shí)能影響活性刺激引起的

20、BDNF下游的信號功能，進(jìn)一步證明CPE能影響TrkB活性依賴的膜表面分布。
　　 8.CPE調(diào)控活性條件下BDNF-TrkB所介導(dǎo)的樹突棘生長及可塑性。
　　 研究已表明，BDNF-TrkB信號通路能夠影響樹突棘的生長、分支及動態(tài)變化。我們因此想驗(yàn)證，CPE對于BDNF-TrkB所介導(dǎo)的另一功能，來進(jìn)一步證明，CPE能夠影響TrkB活性依賴的神經(jīng)元膜表面分布。轉(zhuǎn)染了Ctr siRNA或CPE siRNA的海馬神經(jīng)元，分

21、別經(jīng)BDNF單獨(dú)處理10min或經(jīng)Glycine(10min)+BDNF(10min)處理，然后檢測樹突棘形態(tài)的變化。在過表達(dá)Ctr
　　 siRNA組，Glycine+BDNF組較單獨(dú)加BDNF作用組，能更加促進(jìn)樹突棘的密度增加，及樹突棘大小的增加，但干擾了CPE的表達(dá)后，明顯的抑制了這種現(xiàn)象。因此說明，CPE能夠影響活性刺激引起樹突棘的生長，也同時(shí)進(jìn)一步證明CPE在影響TrkB活性依賴的膜表面分布過程中發(fā)揮重要作用。

22、　　 五、結(jié)論:
　　 CPE分子確實(shí)能夠通過影響海馬神經(jīng)元活性介導(dǎo)的TrkB受體的胞內(nèi)運(yùn)輸，最終影響TrkB受體的活性依賴的上膜。TrkB胞內(nèi)近膜區(qū)的BOX2區(qū)域是介導(dǎo)它與CPE胞內(nèi)域結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域；CPE的第462-466個(gè)aa區(qū)域是介導(dǎo)它與TrkB△EX結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。CPE分子在調(diào)控TrkB受體活性依賴的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)而影響TrkB的活性引起的膜表面表達(dá)水平的同時(shí)，對于BDNF在活性條件下所介導(dǎo)的下游信號通路功能及樹突棘