BDNF-TrkB通路和SIRT1參與硫化氫拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷.pdf

1、【研究背景與目的】：
　　同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的病理進(jìn)展中具有重要作用。硫化氫(Hydrogen sulfide, H2S)是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑，具有抗氧化、抗凋亡作用。本課題組的以往研究發(fā)現(xiàn) H2S能夠拮抗 Hcy的神經(jīng)細(xì)胞毒性，但其機(jī)制尚未闡明。
　　腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurop

2、hic factor, BDNF)是由神經(jīng)元分泌的，在神經(jīng)細(xì)胞的分化、存活、發(fā)育中起到重要作用。作為 Sirtuins家庭中的一員，沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silent information regulator, SIRT1)在大腦、小腦及海馬中均有表達(dá)，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝、衰老等起到重要作用。因而，我們將從 BDNF和SIRT1的角度探討 H2S拮抗 Hcy神經(jīng)毒性的機(jī)制。
　　為此，本實(shí)驗(yàn)以側(cè)腦室注射 Hcy的SD大鼠為 Hc

3、y神經(jīng)毒性的動(dòng)物模型，探討H2S對(duì)Hcy損傷海馬神經(jīng)元的拮抗作用以及 BDNF/TrkB通路和SIRT1對(duì)H2S抗Hcy損傷海馬神經(jīng)元的介導(dǎo)作用。
　　【方法】：
　　Tunel(Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling)法分析大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況；Western blotting檢測(cè)大鼠海馬組織糖調(diào)節(jié)蛋白78(G

4、lucose regulated protein78, GRP78)， C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)以及 cleaved caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)；Elisa法測(cè)試大鼠海馬組織中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量。
　　【結(jié)果】：
　　1.同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損

5、傷
　　Tunel染色結(jié)果顯示 Hcy(0.6,2.0μmol/d×7 d, icv)可誘導(dǎo)海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，表明 Hcy可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡。
　　Western blotting檢測(cè) ER應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志蛋白(GRP78, CHOP and cleaved caspase-12)表達(dá)水平，結(jié)果顯示Hcy(0.2,0.6,2.0μmol/d×7 d, icv)可濃度依賴性地增加大鼠海馬 GRP78，CHOP以及 cle

6、aved caspase-12蛋白的表達(dá)，表明 Hcy可引起大鼠海馬 ER應(yīng)激。
　　Elisa法檢測(cè)大鼠海馬組織 MDA的含量，結(jié)果顯示 Hcy(0.2,0.6μmol/d×7 d, icv)可增加大鼠海馬 MDA含量，表明 Hcy可誘導(dǎo)大鼠海馬氧化應(yīng)激。
　　2.硫化氫拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷
　　Tunel染色結(jié)果顯示NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)改善了Hcy(0.6μmol

7、/d×7 d, icv)導(dǎo)致海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，表明 H2S可拮抗 Hcy誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡。
　　檢測(cè)大鼠海馬組織 ER應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志蛋白(GRP78, CHOP and cleaved caspase-12)表達(dá)水平，結(jié)果顯示 NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)能明顯抑制 Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)導(dǎo)致大鼠海馬 GRP78，CHOP以及 cleaved caspase-12蛋白表達(dá)的

8、增加。上述結(jié)果表明 H2S可抑制 Hcy誘導(dǎo)大鼠海馬 ER應(yīng)激。
　　檢測(cè)大鼠海馬組織 MDA的含量，結(jié)果顯示 NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)顯著降低 Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)引起海馬 MDA水平的增加，表明 H2S能減輕 Hcy誘導(dǎo)大鼠海馬氧化應(yīng)激。
　　3. BDNF/TrkB通路抑制劑 K252a逆轉(zhuǎn)硫化氫對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的拮抗作用
　　Tunel染

9、色結(jié)果顯示 BDNF受體酪氨酸蛋白激酶 B(TrkB)的特異性抑制劑 K252a(1μg/d×9 d, icv)能明顯逆轉(zhuǎn) NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)誘導(dǎo)海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的抑制作用，表明 BDNF/TrkB通路參與H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的拮抗作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示 K252a(1μg/d×9 d, icv)能明

10、顯逆轉(zhuǎn) NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)導(dǎo)致大鼠海馬 GRP78，CHOP以及 cleaved caspase-12蛋白表達(dá)增加的抑制作用。上述結(jié)果表明 BDNF/TrkB通路參與H2S抑制 Hcy誘導(dǎo)海馬ER應(yīng)激。
　　檢測(cè)大鼠海馬組織 MDA的含量，結(jié)果顯示 K252a(1μg/d×9 d, icv)能明顯逆轉(zhuǎn)NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip

11、)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)引起海馬 MDA水平增加的抑制作用，表明 BDNF/TrkB通路參與H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)海馬氧化應(yīng)激損傷的改善作用。
　　4. SIRT1抑制劑 Sirtinol逆轉(zhuǎn)硫化氫對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的拮抗作用
　　Tunel染色結(jié)果顯示 SIRT1的特異性抑制劑 Sirtinol(10 nmol/d×9 d, icv)能明顯逆轉(zhuǎn) NaHS(100μmol/kg/d×9

12、 d, ip)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)誘導(dǎo)海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的抑制作用，表明 SIRT1參與H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的拮抗作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示 Sirtinol(10 nmol/d×9 d, icv)能明顯逆轉(zhuǎn) NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)導(dǎo)致大鼠海馬 GRP78，CHOP以及 cleave

13、d caspase-12蛋白表達(dá)增加的抑制作用。上述結(jié)果表明 SIRT1參與H2S抑制 Hcy誘導(dǎo)大鼠海馬 ER應(yīng)激。
　　檢測(cè)大鼠海馬組織 MDA的含量，結(jié)果顯示 Sirtinol(10 nmol/d×9 d, icv)能明顯逆轉(zhuǎn) NaHS(100μmol/kg/d×9 d, ip)對(duì)Hcy(0.6μmol/d×7 d, icv)引起海馬 MDA水平增加的抑制作用，表明 SIRT1參與H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)海馬氧化應(yīng)激的改善作用。<