硫化氫及炔丙基半胱氨酸抗心血管炎癥反應(yīng)研究.pdf

1、[目的]:炎癥反應(yīng)在心血管系統(tǒng)疾病如心肌缺血(myocardial ischemia)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)等發(fā)病過程中起重要作用。信號分子硫化氫(hydrogensulfide，H2S)在心血管疾病中發(fā)揮重要的作用。
　　 本研究旨在觀察外源性H2S對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical vein endot

2、helial cells，HUVEC)的炎癥反應(yīng)，同時觀察外源性H2S對心肌梗死大鼠心肌炎癥反應(yīng)、重構(gòu)以及血管新生的影響及可能機(jī)制，以及內(nèi)源性H2S調(diào)節(jié)劑炔丙基半胱氨酸(S-propargyl-cysteine，SPRC)，對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及對TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC的炎癥反應(yīng)的影響，并分別探索SPRC抗炎的可能機(jī)制，旨在闡明H2S在心血管炎癥反應(yīng)中的作用并開發(fā)

3、出有效的治療心血管炎癥的藥物。
　　 [方法]:
　　 1.采用TNF-α誘導(dǎo)HUVEC功能紊亂，以地塞米松(dexamethasone，Dex)和乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)為陽性對照；采用細(xì)胞黏附試驗觀察NariS對U937單核細(xì)胞與TNF-α激活的HUVEC黏附的影響；實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(realtime reverse transcription-polymerase cha

4、in reaction，realtimeRT-PCR)觀察NaHS對TNF-α誘導(dǎo)的黏附分子，如細(xì)胞間黏附分子(intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesionmolecule-1，VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)和-選擇素(E-selectin)的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測NaHS對TNF-α誘導(dǎo)的ICA

5、M-1、VCAM-1、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的蛋白表達(dá)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的磷酸化、IκBα的降解以及核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)p65磷酸化和轉(zhuǎn)位的影響；免疫熒光檢測TNF-α誘導(dǎo)的NaHS對NF-κB p65轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，RO

6、S)的影響；
　　 2.冠狀動脈前降支永久性結(jié)扎制備大鼠心肌梗死模型，給予NaHS或DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)及溶媒對照，分別于心肌梗死后3、14、42天取材。Realtime RT-PCR觀察NaHS對ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的mRNA表達(dá)；采用Western blot法檢測N

7、aHS對iNOS、toll樣受體2(toll like receptor2，TLR2)、內(nèi)皮依賴性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、Ⅰ和Ⅲ型膠原(collagen)、HO-1、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionase-γ-lyasis，CSE)、金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothe

8、lial growth factor，VEGF)、MAPK的磷酸化、Akt的激活；免疫組織化學(xué)法觀察NaHS對iNOS、ICAM-1、VEGF、CD34、Ⅰ和Ⅲ型膠原表達(dá)以及CD68+的炎癥細(xì)胞浸潤；Masson染色觀察NaHS對心肌纖維化的的影響；超聲心電圖觀察NaHS對心功能的影響；體外培養(yǎng)原代心肌成纖維細(xì)胞，采用血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激，Western blot觀察NariS對心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白(Ⅰ型膠

9、原、MMPs)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate oxidase4，Nox4)表達(dá)及信號通路(p38 MAPK)激活的影響；免疫熒光觀察NaHS對AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原表達(dá)的影響；
　　 3.采用TNF-α誘導(dǎo)HUVEC功能紊亂，同時以Dex和NAC為陽性對照；采用細(xì)胞黏附試驗觀察SPRC對U937單核細(xì)胞與TNF-α激活的HUVEC黏附的影響

10、；Western blot檢測SPRC對TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1、CSE的蛋白表達(dá)、MAPK的磷酸化、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化的影響；免疫熒光檢測TNF-α誘導(dǎo)的SPRC對NF-κB p65轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)ROS的影響；
　　 4.采用LPS誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，采用RT-PCR觀察SPRC對LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)，TNF-α、NOS和ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響；酶聯(lián)免疫吸收法(enz

11、yme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測SPRC對LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放的影響；Western blot檢測SPRC對Akt磷酸化的影響以及SPRC對LPS誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化、IκBα的降解以及NF-κBp65磷酸化的影響；免疫熒光檢測SPRC對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的影響；
　　 [結(jié)果]:
　　 1.NaHs劑量依賴性的抑制TNF-α誘導(dǎo)ICAM-1和VCAM-1蛋

12、白和mRNA表達(dá)、P-selectin和E-selectin mRNA表達(dá)以及U937單核細(xì)胞與HUVEC的黏附；NaHS劑量依賴性誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，同時NaHS還能夠在TNF-α刺激的HUVEC中劑量依賴性誘導(dǎo)HO-1表達(dá)；NaHS劑量依賴性的抑制TNF-α誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生、NF-κB激活(通過IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核轉(zhuǎn)位評價)；
　　 2.NaHS明顯抑制心肌梗死后3、14天的ICAM-1、VCAM-1

13、、TNF-α和iNOS的mRNA的表達(dá)以及心肌梗死后3天的CD68+炎癥細(xì)胞浸潤、NF-κB的激活、TLR2、ICAM-1和iNOS表達(dá)，而PAG則部分的加重心肌梗死后炎癥反應(yīng)；NaHS明顯改善心功能、緩解心肌重構(gòu)及纖維化并促進(jìn)新生血管，PAG則加重心肌重構(gòu)及纖維化并抑制血管新生；NaHS明顯促進(jìn)心肌梗死后HO-1、CSE以及VEGF表達(dá)；并可激活存活通路Akt，并抑制p38通路的激活；在體外培養(yǎng)的原代心肌成纖維細(xì)胞中，NaHS可抑制A

14、ngⅡ誘導(dǎo)的MMP-2、MMP-9、Ⅰ型膠原和Nox4表達(dá)，同時NaHS還能夠抑制p38通路的激活；
　　 3.SPRC劑量依賴性的抑制TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)和U937單核細(xì)胞與HUVEC的黏附；同時SPRC可明顯誘導(dǎo)TNF-α刺激的HUVEC細(xì)胞中CSE表達(dá)；SPRC有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、JNK1/2激活、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核轉(zhuǎn)位；
　　 4.S

15、PRC劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS和ICAM-1 mRNA表達(dá)和TNF-α mRNA表達(dá)和蛋白；SPRC劑量依賴性的激活磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/Akt通路：SPRC有效抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2激活、IKBα的降解以及NF-κB p65磷酸化、細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。
　　 [結(jié)論]:
　　 1.外源性H2S能有效的抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)

16、制與上調(diào)HO-1表達(dá)、抑制NF-κB激活相關(guān)；
　　 2.外源性H2S可抑制急性心肌梗死引起的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制至少與抑制NF-κB信號通路而抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)；外源性H2S可明顯改善心肌功能，其作用與H2S抑制心肌重構(gòu)、纖維化、促進(jìn)血管新生相關(guān)；
　　 3.SPRC能通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)表達(dá)而抑制U937單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，其機(jī)制與調(diào)節(jié)CSE表達(dá)、抑制NF-κB信號通路相關(guān)；