硫化氫促血管新生機(jī)制研究——硫化氫靶分子VEGFR2的發(fā)現(xiàn).pdf

1、硫化氫(Hydrogen Sulfide，H2S)是一種有臭雞蛋味的無(wú)色氣體，大量吸入可致中毒，過(guò)去一直被認(rèn)為是毒性氣體。但是，從上世紀(jì)90年代開始，人們對(duì)硫化氫這種氣體物質(zhì)有了新的認(rèn)識(shí)。1989年，科學(xué)家在大鼠和人腦中檢測(cè)到了內(nèi)源性的H2S，提示H2S可能具有一定的生理作用。近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞自身能產(chǎn)生H2S，在正常大鼠的血液中H2S濃度達(dá)到46μ mol/L，在腦中H2S濃度高達(dá)100μmol/L。內(nèi)源性H2S主要

2、由胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE)或胱硫醚-β-合酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CSE主要存在于心血管系統(tǒng)中，CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中。內(nèi)源性H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均有重要的生理調(diào)節(jié)功能。另外，H2S是一種小分子量的氣體分子，能穿透細(xì)胞膜直接起效，在體內(nèi)產(chǎn)生且受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)控。因此，近些年來(lái)，人們對(duì)H2S不斷加以重視

3、，將其定位于包括一氧化氮、一氧化碳在內(nèi)的氣體信號(hào)分子家族，是第三個(gè)氣體信號(hào)分子。
　　在心血管系統(tǒng)，H2S通過(guò)興奮KATP通道，增加KATP通道電流，使細(xì)胞膜出現(xiàn)超極化而使血管平滑肌舒張，降低血壓;H2S可抑制平滑肌細(xì)胞異常增殖，并促進(jìn)其凋亡，緩解血管結(jié)構(gòu)重構(gòu);另外，H2S對(duì)心臟有負(fù)性肌力作用，并能減輕缺血再灌注引起的心肌損傷。本課題組于2007年首次研究發(fā)現(xiàn)，H2S能夠促進(jìn)血管新生，該結(jié)果不僅在恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞株RF

4、/6A上，而且在C57小鼠Matrigel plug模型上得到證實(shí)。2009年本課題組在大鼠單側(cè)后肢缺血模型中，又進(jìn)一步證實(shí)，H2S能夠促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生。另外，H2S的促血管新生的效應(yīng)在雞胚絨毛膜尿囊CAM模型中得到證實(shí)。
　　血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上長(zhǎng)出新的毛細(xì)血管，其過(guò)程包括血管外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成子代血管支。這一現(xiàn)象可發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織器官生長(zhǎng)、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移、糖尿病等多種生理、病理

5、過(guò)程中。在血管新生過(guò)程中，多種生長(zhǎng)因子起到促進(jìn)/抑制調(diào)控作用，其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)作為促進(jìn)因子，其激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2，VEGFR-2)產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是血管新生過(guò)程中最核心的信號(hào)通路，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移。
　　血管新生與血管內(nèi)

6、皮細(xì)胞的增殖和遷移有密切關(guān)聯(lián)，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過(guò)程在血管新生中起著重要的作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示，H2S在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞有促進(jìn)體外血管新生的作用。NaSH儀在低濃度（10μmol/L）能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖;而NaSH在30-200μmol/L都能顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和體外管腔形成。并且，H2S促進(jìn)血管新生的作用不依賴于VEGF的表達(dá)變化，但是依賴于VEGFR-2/PI3K/Akt信號(hào)通路。另外，H2S與重組蛋白VEGFR-2

7、的直接反應(yīng)結(jié)果顯示H2S可以直接提高VEGFR-2的活性，但對(duì)PI3K/Akt的活性沒有影響。這就提示，H2S在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的靶分子是VEGFR-2。因此，本課題以VEGFR-2為研究對(duì)象，主要針對(duì)H2S激活VEGFR-2的具體機(jī)制進(jìn)行研究，以闡明H2S促進(jìn)血管新生的具體機(jī)制。
　　首先，我們進(jìn)一步研究了H2S對(duì)VEGFR-2的作用。VEGFR-2中含有多個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn):Tyr951、Tyr996、Tyr1054、Tyr10

8、59、Tyr1175以及Tyr1214。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF(10ng/ml)可以顯著提高所有磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平，而NaSH(50μmol/L)儀對(duì)Tyr1175位點(diǎn)的磷酸化水平有提高作用，這提示，H2S對(duì)VEGFR-2的激活很可能不同于其經(jīng)典激活劑VEGF的激活方式。用siRNA將VEGFR-2的基因沉默以后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，VEGFR-2蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明基因沉默體系建立成功;而且與轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照的細(xì)

9、胞相比，H2S在轉(zhuǎn)染VEGFR-2 siRNA的內(nèi)皮細(xì)胞上的促細(xì)胞遷移作用下降。這進(jìn)一步說(shuō)明，VEGFR-2在H2S促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。另外，我們分別比加入H2S提前0.5小時(shí)和24小時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加VEGF的中和抗體anti-VEGF，觀察到提前0.5小時(shí)加入anti-VEGF不能阻斷H2S的促進(jìn)細(xì)胞遷移作用;而提前24小時(shí)加入anti-VEGF卻能阻斷H2S的促進(jìn)細(xì)胞遷移作用。這個(gè)結(jié)果提示，H2S激活VEG

10、FR-2進(jìn)而促進(jìn)血管新生的作用需要基礎(chǔ)水平VEGF的作用。
　　其次，我們對(duì)VEGFR-2重組蛋白進(jìn)行酶解之后的質(zhì)譜檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間存在一個(gè)二硫鍵，當(dāng)NaSH處理之后，這個(gè)二硫鍵被打斷，而且沒有發(fā)現(xiàn)任何其他形式的修飾。之后我們合成了VEGFR-2中主要功能片段的多肽，以及用二硫鍵連接的Cys1045-Cys1024模擬六肽，用NaSH與功能肽段、模擬六肽、20種基本氨基酸和胱氨

11、酸進(jìn)行直接反應(yīng)后用ESI-MS進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析，分析結(jié)果顯示，NaSH對(duì)功能肽段和20種基本氨基酸都沒有任何修飾作用，但是可以打斷模擬六肽和胱氨酸中的二硫鍵。這些結(jié)果證實(shí)，NaSH對(duì)VEGFR-2的直接作用很可能僅僅是打斷了該受體中的二硫鍵，而沒有產(chǎn)生任何其他的修飾作用。為了進(jìn)一步證實(shí)VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間的二硫鍵是NaSH作用的靶點(diǎn)，我們將Cys1045位突變?yōu)楸彼?Ala)，阻止Cys1045與Cys1

12、024之間形成二硫鍵。突變之后的VEGFR-2其激酶活性提高，而且H2S不能再直接激活突變體VEGFR-2(C1045A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間的二硫鍵是H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用靶點(diǎn)，我們用慢病毒載體將突變的VEGFR-2(C1045A)轉(zhuǎn)染入HUVECs并使其表達(dá)。在劃痕損傷實(shí)驗(yàn)中，與轉(zhuǎn)染了對(duì)照空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染VEGFR-2(C1045A)的HUVECs，其細(xì)胞遷移作用明顯增強(qiáng)。雖然在

13、轉(zhuǎn)染了對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞中，H2S仍有促遷移作用，但轉(zhuǎn)染了突變VEGFR-2(C1045A)的細(xì)胞，H2S的促遷移作用被取消。這些數(shù)據(jù)不僅表明，Cys1045-Cys1024二硫鍵作為一種抑制序列發(fā)揮作用，也證明作為VEGFR-2介導(dǎo)的H2S促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的靶結(jié)構(gòu)，Cys1045-Cys1024二硫鍵發(fā)揮著復(fù)雜作用。另外，我們還測(cè)定了遷移與未遷移的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的活性氧(ROS)水平。定量分析表明，與未遷移的細(xì)胞相比，遷移的細(xì)胞內(nèi)ROS水

14、平明顯增加，這表明在細(xì)胞遷移過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫的細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境;而免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，在遷移過(guò)程中的細(xì)胞，ROS與VEGFR-2共定位，這進(jìn)一步表明在細(xì)胞遷移過(guò)程中，VEGFR-2處于一個(gè)短暫的細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境。
　　然后，我們探討了H2S打斷二硫鍵的作用機(jī)制，并對(duì)H2S發(fā)揮作用的主要形式作初步的探索。用與NaSH相同氧化還原能力的維生素C處理胱氨酸，ESI-MS檢測(cè)分析顯示，維生素C不能打斷胱氨酸的二硫鍵，這提示，NaSH

15、打斷二硫鍵的作用不完全是因?yàn)槠溥€原能力。H2S在水溶液中通常以H2S氣體和HS-離子兩種形式存在。pH值越高，HS-離子形式越多;pH值越低，H2S氣體形式越多。我們?cè)诓煌琾H條件下進(jìn)行NaSH與胱氨酸或者模擬六肽的直接反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系pH≤5.5時(shí)，NaSH將不再能夠打開胱氨酸或者六肽之間的二硫鍵。這提示，很可能是HS-在發(fā)揮打斷二硫鍵的作用。在研究H2S和胱氨酸直接反應(yīng)的過(guò)程中，我們還找到了中間產(chǎn)物Cys-SSH，推測(cè)H2

16、S打斷二硫鍵的過(guò)程是一個(gè)以HS-作為親核集團(tuán)攻擊二硫鍵的兩步反應(yīng)。而且這個(gè)推測(cè)也用量子化學(xué)計(jì)算得到證實(shí)，這對(duì)我們深入了解H2S打斷二硫鍵的具體機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　最后，檢測(cè)產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的酶CSE和CBS在HUVECs上的表達(dá)與分布。免疫熒光染色結(jié)果顯示，HUVECs不僅有CSE表達(dá)，而且同時(shí)有CBS表達(dá)。CSE主要分布在靠近細(xì)胞膜的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，CBS則主要分布于胞漿。而且，免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，在HUVECs，CSE和C

17、BS都與VEGFR-2共定位，這提示在VEGFR-2存在的情況下，這些內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源性H2S。這為研究?jī)?nèi)源性H2S與VEGFR-2的作用及內(nèi)源性H2S在心血管系統(tǒng)的作用打下了一定的基礎(chǔ)。
　　總之，我們深入研究了H2S促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的機(jī)制，特別是深入研究了H2S究竟如何激活其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的靶分子VEGFR-2。首次證實(shí):①VEGFR-2的Cys1045與Cys1024之間存在二硫鍵;②該二硫鍵是H2S作用于VEGFR