硫化氫的植物生理功能及其分子機(jī)制研究.pdf

1、硫化氫(H2S)作為一種新的氣體信號(hào)分子已經(jīng)被證明在動(dòng)植物體內(nèi)起著非常重要的調(diào)控作用。本論文首先以菠菜為實(shí)驗(yàn)材料研究了H2S對(duì)植物光合作用的調(diào)控，并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法深入探討了H2S參與調(diào)控了植物體哪些蛋白的表達(dá);此外，由于鐵的吸收和植物光合作用緊密相關(guān)，因此深入研究了H2S對(duì)植物鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用機(jī)制的影響;最后，以大麥為材料，研究了H2S在緩解植物遭受鋁毒害中的作用機(jī)制。主要結(jié)論如下:
　　 1.本研究首先以菠菜（Spin

2、acia oleracea）為實(shí)驗(yàn)材料，研究了H2S在調(diào)控菠菜幼苗光合中的作用。(i)硫氫化鈉(NaHS)，一種H2S供體，可以增加菠菜葉片的葉綠素含量。(ii) NaHS以一種劑量依賴的方式影響菠菜幼苗生長(zhǎng)、可溶性蛋白含量和光合作用，其中100μM NaHS為最適濃度。(iii)在最適NaHS處理?xiàng)l件下，可以顯著增加功能葉綠體中基粒片層的數(shù)目。(iv)在最適NaHS處理?xiàng)l件下，光飽和點(diǎn)、最大凈光合速率、羧化效率和光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率

3、都達(dá)到了最大值，然而光補(bǔ)償點(diǎn)和暗呼吸效率卻有顯著的下降。(v)在NaHS處理的條件下，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RuBISCO)的活性和RuBISCO大亞基(RuBISCO LSU)的蛋白表達(dá)也顯著增加。(vi)總巰基含量、谷胱甘肽和半胱氨酸水平、內(nèi)源H2S含量、O-乙酰絲氨酸巰基裂解酶和L-半胱氨酸脫巰基酶活性均有不同程度的增加，這些數(shù)據(jù)表明了NaHS可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)的巰基還原修飾。（vii）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步研究表

4、明:編碼RuBISCO大亞基(RBCL、小亞基(RBCS)、鐵氧還硫氧還蛋白還原酶（FTR）、鐵氧還蛋白(FRX)、硫氧還蛋白m（TRX-m）和硫氧還蛋白f(TRX-f)、NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶(NADP-MDH)以及O-乙酰絲氨酸巰基裂解酶(OAS)的基因表達(dá)在最適H2S處理?xiàng)l件下均上調(diào)，然而一些編碼絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SERAT)、乙醇酸氧化酶(G YX)和細(xì)胞色素氧化酶(CCO)基因均呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)。這些結(jié)果說(shuō)明了RuBISCO

5、酶的活性和巰基還原修飾功能在植物光合作用中起著非常重要的作用，即H2S主要是通過(guò)調(diào)控RuBISCO酶的活性和巰基還原修飾相關(guān)地基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)植物光合作用。
　　 2.為了更深入研究H2S在植物體內(nèi)的生理功能，第一次利用蛋白組學(xué)的方法研究H2S所調(diào)控的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中哪些蛋白發(fā)生了變化。菠菜幼苗用100μM NaHS處理30天，利用雙向電泳技術(shù)和MALDI-TOF MS技術(shù)分析了H2S處理的菠菜葉片蛋白差異表達(dá)，每張電泳圖譜上

6、分離得到1000多個(gè)蛋白點(diǎn):其中有92個(gè)蛋白的表達(dá)變化是2倍以上，65個(gè)蛋白在H2S處理下呈表達(dá)上調(diào)，而27個(gè)蛋白呈下調(diào)表達(dá)。這些蛋白按照其功能分成9組:(1)能量產(chǎn)生和光合相關(guān)蛋白;(2)細(xì)胞拯救、發(fā)育和防御相關(guān)蛋白;(3)轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和折疊修飾相關(guān)蛋白;(4)分子伴侶、輔助因子和細(xì)胞組分合成相關(guān)蛋白;(5)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白;(6)氨基酸、氮和硫代謝相關(guān)蛋白;(7)碳組分和碳代謝相關(guān)蛋白;(8)磷代謝相關(guān)蛋白;(

7、9)脂質(zhì)、脂肪酸和類異戊二烯代謝相關(guān)蛋白。這些蛋白主要是定位在葉綠體、線粒體、核仁、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中。該研究結(jié)果表明H2S參與調(diào)控植物生理功能的各個(gè)方面，并且對(duì)植物光合作用過(guò)程中碳固定起著非常重要的作用。同時(shí)，這些蛋白信息將為后續(xù)研究H2S在植物體內(nèi)的功能提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 3.鐵的吸收與植物光合作用緊密相關(guān)。本研究探討了在缺鐵條件下H2S對(duì)玉米（Zea mays）幼苗鐵吸收機(jī)制的影響。(i) H2S供體Na

8、HS可以緩解玉米幼苗生長(zhǎng)在缺鐵下導(dǎo)致的葉片脈間失綠。(ii)超微結(jié)構(gòu)顯示在缺鐵條件下生長(zhǎng)的玉米幼苗葉肉細(xì)胞葉綠體中的基粒片層數(shù)目顯著減少，相反，H2S處理后，葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育良好，基粒片層數(shù)目有顯著增加。(iii) H2S處理可以增加玉米幼苗體內(nèi)鐵的積累，主要是通過(guò)調(diào)控三價(jià)鐵螯合還原酶（FRO1）、鐵結(jié)合蛋白(IBP)和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)子(IRT)的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。(iv)在缺鐵條件下，H2S處理可以加強(qiáng)玉米根部植物鐵載體(phytoside

9、rophore，PSs)的積累和分泌。除此之外，在鐵饑餓條件下玉米鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)子基因（ZmYS1）表達(dá)被誘導(dǎo)，然而在外源加入NaHS之后又有顯著的下降。(v)在缺鐵條件下，H2S通過(guò)促進(jìn)RuBISCOLSU和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的蛋白表達(dá)和一些編碼RuBISCO LSU（RBCL）、SSU(RBCS)、D1蛋白(psbA)和PEPC的基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物光合作用。綜上所述，結(jié)果表明了H2S與植物對(duì)鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用緊密相關(guān)，

10、隨后可以增加葉綠素的生物合成、葉綠體的發(fā)育和植物光合作用。
　　 4.以大麥（Hordeum vulgare）為材料，研究了H2S在緩解鋁毒中的作用機(jī)制。大麥幼苗先用H2S供體NaHS進(jìn)行預(yù)處理，隨后用鋁處理來(lái)研究其對(duì)根伸長(zhǎng)、鋁積累、鋁誘導(dǎo)的檸檬酸分泌和氧化脅迫、質(zhì)膜(PM) H+-ATPase的表達(dá)和果膠甲基脂酶活性的影響。結(jié)果顯示了H2S可以顯著地緩解由鋁毒造成的根伸長(zhǎng)抑制，這與H2S處理下鋁在幼苗中積累的減少密切相關(guān)，同時(shí)

11、，NaHS預(yù)處理也顯著的增加了鋁誘導(dǎo)的檸檬酸分泌。H2S通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)的活性來(lái)緩解由于鋁誘導(dǎo)的氧化脅迫，包括脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS的爆發(fā)。除此之外，在外源加入NaHS之后，鋁誘導(dǎo)PM H+-ATPase蛋白表達(dá)的減少和果膠甲基脂酶活性的增強(qiáng)也被逆轉(zhuǎn)?？傊Y(jié)果表明:H2S在保護(hù)植物免受鋁毒害作用中起著緩解作用，主要是通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶的活性、增加檸檬酸分泌和檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)、增加PM H+-ATPase蛋白表達(dá)和減少果膠甲基脂酶活