外源性硫化氫對心肺復蘇后腦線粒體的作用及其機制.pdf

1、目的:線粒體功能障礙在心臟驟停及心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后腦損傷的病理生理變化中起著非常重要的作用。最近在許多對缺血再灌注損傷的研究中，都發(fā)現(xiàn)硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）及其供體可對目標臟器線粒體功能起到一定的保護作用。本研究將大鼠作為研究對象，建立心臟驟停及心肺復蘇模型，探討經(jīng)靜脈注射H2S供體NaHS是否可對心肺復蘇后腦線粒體發(fā)揮保護作用，并初步闡明其可能的

2、作用機制。
　　方法:SD雄性大鼠隨機分為3組：（1）假手術(shù)組：僅進行麻醉、經(jīng)口腔氣管插管和經(jīng)股動、靜脈置管等操作；（2）CPR組：采用經(jīng)皮電刺激心外膜法制備心臟驟停模型并成功進行心肺復蘇，在復蘇前1分鐘，經(jīng)股靜脈注射生理鹽水（1.67ml/kg），此后持續(xù)泵入生理鹽水(5ml/kg/h)3小時；（3）CPR+NaHS組：采用經(jīng)皮電刺激心外膜法制備心臟驟停模型并成功進行心肺復蘇，在復蘇前1分鐘經(jīng)股靜脈注射NaHS（0.5mg/kg

3、）,此后持續(xù)泵入NaHS（1.5mg/kg/h）3小時。復蘇后24小時觀察各組大鼠生存情況，利用NDS評分系統(tǒng)評價各組大鼠神經(jīng)功能損傷情況。隨后處死大鼠，取腦皮質(zhì)進行后續(xù)研究：①尼氏染色觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞損傷情況；②在透射電鏡下觀察各組大鼠腦組織線粒體損傷情況；③取各組大鼠腦皮質(zhì)制作單細胞懸液，流式細胞術(shù)測定各組大鼠單細胞懸液中氧自由基(reactive oxygen species,ROS）、Ca2+和線粒體膜電位（mitoc

4、hondrial membrane potential,MMP）的變化情況；④提取各組大鼠腦皮質(zhì)線粒體，化學發(fā)光法測定其線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pores,mPTP）變化情況，Western blot法測定各組大鼠線粒體內(nèi)外細胞色素c(cytochrome c,cyt c)變化情況；⑤化學發(fā)光法測定各組大鼠皮質(zhì)內(nèi)ATP含量；⑥Real Time PCR法測定各組大鼠

5、皮質(zhì)內(nèi)線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）含量；⑦Western blot法測定各組大鼠皮質(zhì)內(nèi)過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactvator-1α，PGC-1α)、核呼吸因子-1（nuclear respiratory factor-1，NRF-1)和核因子紅細胞系2相關因子-2（nuclear factor

6、 erythroid2-related factor2，Nrf-2）蛋白的表達變化。
　　結(jié)果:①與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組大鼠在復蘇成功后24小時NDS評分均明顯下降（P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組大鼠NDS評分顯著提高（P＜0.01）；②與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組大鼠神經(jīng)細胞及皮質(zhì)線粒體均有不同程度的損傷，但是CPR+NaHS組大鼠二者損傷明顯較CPR組減輕；③與假手術(shù)組

7、相比，CPR組與CPR+NaHS組大鼠腦單細胞懸液中ROS、Ca2+濃度均明顯上升（P＜0.01），而線粒體MMP均明顯下降（P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組大鼠腦單細胞懸液中ROS、Ca2+濃度均有明顯下降（P＜0.01），而線粒體MMP得到提升（P＜0.05）；④與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組線粒體mPTP均明顯增加（P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組線粒體mPTP顯著下降（P＜0.0

8、1）；⑤與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組胞質(zhì)內(nèi)從線粒體內(nèi)漏出的cyt c均明顯增多（P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組胞質(zhì)內(nèi)cyt c含量下降（P＜0.05）；⑥與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)ATP含量均明顯減少（P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)ATP含量增多（P＜0.05）；⑦與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)mtDNA含量均明顯增多（

9、P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)mtDNA含量增多趨勢更為明顯（P＜0.05）；⑧與假手術(shù)組相比，CPR組與CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)PGC-1α、NRF-1、Nrf-2表達量均明顯增多（NRF-1：P＜0.05，余指標P＜0.01），與CPR組相比，CPR+NaHS組皮質(zhì)組織內(nèi)三種蛋白表達量增多趨勢更為明顯（P＜0.01）。
　　結(jié)論:外源性硫化氫可明顯改善心肺復蘇后24小時神經(jīng)功能損傷，可能與其顯