硫化氫對小鼠胃底平滑肌張力的調(diào)控作用及其機制.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種無色、易燃的酸性氣體，具有明顯的毒性。多年來的認識主要局限于其毒性作用。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，而且具有重要的細胞保護作用。其主要的合成酶，胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶（cysta-thionine-γ-lyase，CSE）在哺乳動物的不同組織內(nèi)廣泛表達，但是有分布的差異。比如，神經(jīng)細胞以CBS為主要分布，而心血管系統(tǒng)

2、則主要以CSE為主要分布，在消化道內(nèi)，結腸、肝臟主要以CSE為要分布。近年來的研究認為，內(nèi)源性的H2S是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信號分子，廣泛參與了機體的多種生理與病理過程。例如，H2S調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ATP的生成;此外，H2S通過激活ATP敏感的鉀通道調(diào)節(jié)胰島素分泌，參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程;H2S還可以通過影響ATP敏感的鉀通道在心血管系統(tǒng)以及呼吸系統(tǒng)發(fā)揮作用，尤其H2S在對抗缺氧缺血引起的心肌損傷中的作用日

3、益受到重視。一方面，H2S激活蛋白激酶C及肌膜ATP敏感鉀通道，保護大鼠心臟對缺血-再灌注引起的損傷;另一方面，H2S能促進大鼠心肌細胞增殖、血管的平滑肌細胞的增殖遷移。
　　在消化道，食物的機械性消化依賴于消化道的運動，包括蠕動、分節(jié)運動等運動形式，而消化道運動的主體是消化道平滑肌，本身的張力是消化道運動的基礎。消化道平滑肌除了受外來神經(jīng)、腸神經(jīng)和體液因素調(diào)節(jié)之外，也可以通過自身調(diào)節(jié)機制保持其緊張度。例如，細胞內(nèi)的各種生物活性分

4、子，如H2S、NO等可能是自身調(diào)節(jié)機制的重要的活性分子。已有研究證實，胃腸道的黏膜、腸神經(jīng)和平滑肌組織均有CBS和CSE分布，可以產(chǎn)生內(nèi)源性的H2 S;此外，結腸內(nèi)的細菌分解消化產(chǎn)物的過程中會產(chǎn)生H2S。因此，闡明H2S調(diào)控胃腸道運動及其機制具有重要的生理學以及潛在的臨床意義。
　　本文主要通過電生理學以及分子生物學的方法，研究H2S在小鼠胃底平滑肌運動調(diào)控中的作用及其機制。首先，我們研究了H2S對平滑肌經(jīng)典鈣依賴性收縮途徑——興

5、奮收縮耦聯(lián)的影響:利用免疫組織化學的方法檢測了H2S合成酶在小鼠胃平滑肌細胞上的表達情況;采用離體肌條實驗檢測H2S對離體肌條張力的影響;采用細胞內(nèi)記錄的方法檢測H2S對平滑肌細胞膜電位的影響;采用全細胞膜片鉗的方法檢測H2S對單個平滑肌細胞電壓依賴性鉀通道以及L-型鈣通道電流的影響;采用鈣熒光成像技術檢測H2S對細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。其次，探討了H2S對NO生成的影響及其作用機制:利用免疫組織化學的方法檢測H2S合成酶和NO合成酶在

6、小鼠胃平滑肌細胞上的表達情況;采用電化學的方法直接檢測組織內(nèi)H2S和NO的生成情況;采用離體肌條實驗檢測H2S和NO對離體肌條張力的影響;采用蛋白免疫印跡方法檢測H2S對NO合成酶活性的調(diào)節(jié)，同時利用siRNA干擾細胞內(nèi)H2S生成，檢測其對NO合成酶活性的調(diào)節(jié)及其調(diào)節(jié)機制。
　　研究結果如下:
　　一、H2S對小鼠胃底平滑肌運動的調(diào)控及其離子機制
　　1.蛋白免疫印跡結果顯示，在培養(yǎng)的小鼠胃底平滑肌細胞均有表達H2S合

7、成酶CBS和CSE蛋白。
　　2.離體肌條收縮實驗結果顯示，NaHS(H2S供體)可以劑量依賴地增加胃底平滑肌張力;當給予CBS阻斷劑AOAA時，其張力降低，而NaHS可以逆轉AOAA的降低張力的作用;SNP(NO供體)降低平滑肌張力，而NOS阻斷劑L-NAME，則其張力升高。然而，CSE阻斷劑PAG，則幾乎不影響其張力的變化。選用電壓依賴性鉀通道特異性阻斷劑4-AP和L-型鈣通道的阻斷劑尼卡地平預處理，均可以阻斷NaHS對平滑肌

8、的興奮性作用。
　　3.細胞內(nèi)記錄結果顯示，NaHS可以使胃底平滑肌細胞膜電位發(fā)生去極化。
　　4.全細胞膜片鉗實驗結果顯示，NaHS可以降低電壓依賴性鉀通道的電流，增加L-型鈣通道的電流。
　　5.鈣熒光成像實驗結果顯示，NaHS可以增加細胞內(nèi)游離鈣濃度，而這種增加作用可被L-型鈣通道的阻斷劑尼卡地平阻斷。
　　以上結果提示:(1)內(nèi)源性的H2S可以增加胃底平滑肌細胞的張力;(2) H2S降低了電壓依賴性鉀通道

9、電流使細胞膜去極化，進而激活了L-型鈣通道，使鈣離子內(nèi)流增加，最終使得平滑肌張力增加。
　　二、H2S對小鼠胃底平滑肌NO合成的作用及其機制
　　1.蛋白免疫印跡的結果顯示，在培養(yǎng)的小鼠胃底平滑肌細胞均有表達H2S合成酶CBS和CSE蛋白以及NO合成酶eNOS和nNOS蛋白。
　　2.離體肌條收縮實驗結果顯示，NaHS可以增加胃底平滑肌張力，SNP可以降低胃底平滑肌的張力，而NaHS可以部分逆轉SNP誘導的平滑肌張力降

10、低作用;HNO可以顯著降低胃底肌條的張力，而作為陰性對照的KOH對張力并沒有顯著性的變化;NO合酶阻斷劑L-NAME可以削弱NaHS誘導的平滑肌張力增加效果。
　　3.電化學結果顯示，在胃底平滑肌組織中可以實時檢測到H2S和NO的生成;當NO生成量穩(wěn)定后，給予CBS合成酶抑制劑AOAA，可以顯著增加NO的生成效率。
　　4.免疫蛋白印跡實驗結果顯示，NaHS可以降低eNOS合酶的絲氨酸1177位點的磷酸化水平，降低Akt酶絲

11、氨酸308位點、蘇氨酸473位點的磷酸化水平;PI3K阻斷劑LY294002可以阻斷NaHS降低eNOS合酶的絲氨酸1177位點的磷酸化水平的作用;CBS阻斷劑AOAA可以增加eNOS合酶的絲氨酸1177位點的磷酸化水平，增加Akt酶絲氨酸308位點、蘇氨酸473位點的磷酸化水平;給予CBSsiRNA干擾48小時之后，eNOS合酶的絲氨酸1177位點的磷酸化水平增加，Akt酶絲氨酸308位點、蘇氨酸473位點的磷酸化水平增加;eNOS蛋

12、白的表達總量有增加，但Akt激酶的總量未有顯著性變化。
　　以上結果提示:(1)在胃底平滑肌，H2S和NO的合酶均有表達，并且可以穩(wěn)定地生成H2S和NO;(2) H2S可以增加胃底的張力，NO降低胃底的張力，H2S通過PI3K/Akt途徑使eNOS酶活性降低，進而增加平滑肌張力。
　　三、結論
　　以上兩部分的實驗可以歸納為以下幾點:
　　1.在小鼠胃底，平滑肌組織可以利用CBS和CSE合酶產(chǎn)生H2S，也可以利用