硫化氫陰性沙門菌遺傳變異規(guī)律及硫化氫參與沙門菌耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、沙門菌是一種引起食源性腹瀉的常見病原菌，可通過食物、水源進(jìn)行傳播，引發(fā)人類急性腹瀉甚至死亡。通常，絕大多數(shù)沙門菌可以產(chǎn)生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S），因此，H2S是實(shí)驗(yàn)人員初篩與鑒定沙門菌的重要生化指標(biāo)。近幾年H2S陰性沙門菌在世界范圍內(nèi)不斷涌現(xiàn)，尤其在我國，H2S陰性沙門菌的流行更為普遍。沙門菌中，phs操縱子編碼硫代硫酸鹽還原酶，由phsA、phsB、phsC三段基因組成，是沙門菌產(chǎn)生H2S的重要功能基因。研究

2、指出，絕大部分的H2S陰性沙門菌phsA基因發(fā)生了不同類型的突變，可能導(dǎo)致了沙門菌H2S表型的缺失。此外，多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）沙門菌在全球多地涌現(xiàn)。值得注意的是，H2S陰性沙門菌的耐藥菌株也多次被研究人員檢出。由此可見，沙門菌耐藥問題日趨嚴(yán)重。已有研究指出，H2S不僅是細(xì)菌硫代謝的副產(chǎn)物，還在細(xì)菌耐藥過程中發(fā)揮重要作用。目前，已在大腸桿菌、沙門菌等多種細(xì)菌中證實(shí)了這一重要的生物學(xué)功能。這不僅表明

3、氣體分子作為一種新的耐藥方式被人們所認(rèn)知，而且還揭示了細(xì)菌耐藥機(jī)制的復(fù)雜性。然而，H2S作為新的耐藥方式調(diào)控細(xì)菌耐藥的分子機(jī)理卻不得而知。
　　基于全國沙門菌監(jiān)測(cè)平臺(tái)，本實(shí)驗(yàn)室于2006至2013年間共收集到的90株H2S陰性沙門菌。本研究旨在通過對(duì)H2S陰性沙門菌遺傳變異規(guī)律的研究，揭示陰性菌與陽性菌之間的親緣關(guān)系，為我國沙門菌防控策略的制訂提供數(shù)據(jù)參考和科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，探究H2S參與調(diào)控沙門菌耐藥背后可能的分子機(jī)制，為耐藥菌的

4、治療提供新的靶點(diǎn)和思路，也為多重耐藥沙門菌的治療和防控提供依據(jù)。
　　本研究通過細(xì)菌抗生素敏感實(shí)驗(yàn)，分析90株H2S陰性沙門菌自身的耐藥特點(diǎn)、各血清型的耐藥差異以及其與H2S陽性沙門菌在耐藥表型上的不同，重點(diǎn)關(guān)注耐喹諾酮類藥物的沙門菌及多重耐藥菌株，為治療沙門菌感染時(shí)合理選擇抗生素提供重要科學(xué)依據(jù)。對(duì)21種抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，H2S陰性沙門菌對(duì)氨芐西林、替卡西林、慶大霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素及氯霉素的耐藥率高于H2S陽性沙門

5、菌。而對(duì)于頭孢類藥物、亞胺硫霉素、阿米卡星和氨曲南，H2S陰性與陽性沙門菌均表現(xiàn)出普遍的敏感性。90株H2S陰性沙門菌中，有13株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥或者中介耐藥，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些菌株gyrA或parC基因上有關(guān)鍵位點(diǎn)突變。另外，相同血清型的H2S陰陽菌株對(duì)同種類的抗生素耐藥情況存在差異，包括豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌。值得注意的是，在分離的14種不同血清型的H2S陰性沙門菌中，豬霍亂沙門菌不僅耐藥率最高，而且有76％的菌株為MD

6、R菌株。
　　脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）與多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing,MLST）是研究細(xì)菌遺傳與親緣關(guān)系的常用方法。我們通過MLST分析將90株H2S陰性沙門菌分為22種ST型別，其中包括兩種新的ST型：ST1960和ST1961。H2S陰性雞沙門菌形成兩個(gè)克隆群（clonal complex）， CC92與CC1960，而

7、其他血清型的H2S陰性沙門菌分別形成一個(gè) CC。山夫登堡、豬霍亂、乙型副傷寒沙門菌的H2S陰陽菌株分別屬于不同的ST型。相比于H2S陽性菌，陰性的腸炎、鼠傷寒沙門菌的ST型種類更多，而其它血清型的H2S陰陽性菌株的ST型別相同。通過PFGE分析，47株H2S陰性沙門菌與40株H2S陽性沙門菌按照50%的相似度分為三個(gè)聚類組，其中腸炎、乙型副傷寒沙門菌H2S陰陽性菌分別聚類在不同的聚類組中，說明H2S陰性腸炎、乙型副傷寒沙門菌已經(jīng)形成了不

8、同于陽性菌的進(jìn)化分支。鼠傷寒、德比、阿貢納、湯伯遜和火雞沙門菌的 H2S陰陽性菌株分別聚類在同一聚類組里，說明這些血清型的 H2S陰陽性菌株親緣關(guān)系密切。分離于上海的H2S陰性雞沙門菌與分離于廣州H2S陰性腸炎沙門菌ST型相同、PFGE帶型相似，另外分離于玉溪與上海的H2S陰性甲型副傷寒沙門菌具有相同的ST型和PFGE帶型，說明H2S陰性沙門菌存在跨地區(qū)傳播的可能。此外，分離于家畜的H2S陰性德比、鼠傷寒沙門菌與同血清型的人源陽性菌PF

9、GE帶型相似、ST型相同；分離于水源與人源的H2S陰性火雞沙門菌PFGE帶型與ST型完全相同，說明不同樣本來源的沙門菌之間親緣關(guān)系密切，提示我們應(yīng)防范H2S陰性沙門菌通過食物傳播給人類或動(dòng)物。
　　我們利用PCR技術(shù)對(duì)H2S陰性沙門菌的phs操縱子進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行DNA測(cè)序，從基因水平揭示沙門菌H2S表型缺失的原因。通過比對(duì)phs操縱子序列，發(fā)現(xiàn)77株（85%）H2S陰性沙門菌phs基因具有多種突變類型，其中74株（82%）phsA

10、基因發(fā)生了突變。phsA基因中主要有三種突變類型：第760位的移碼突變、第1087位的移碼突變以及第1624位的錯(cuò)義突變；在phsB基因中，主要有四種突變位點(diǎn)：第164位、第314位、第319位及第373位的錯(cuò)義突變；在phsC基因中，主要有兩種突變類型：第577位的無義突變和第754位的錯(cuò)義突變。這些突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物不完整或氨基酸序列改變，從而可能導(dǎo)致沙門菌失去產(chǎn)H2S的能力。總體來說，H2S陰性沙門菌的phs基因突變的多樣性，表明H

11、2S陰性沙門菌phs操縱子序列具有不穩(wěn)定性，但相同血清型之間phs基因序列趨于穩(wěn)定。
　　我們利用no-SCAR（Scarless Cas9 Assisted Recombineering）基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了phsA基因缺失的鼠傷寒沙門菌ATCC14028突變株（ΔphsA突變株）。經(jīng)沙門/志賀瓊脂培養(yǎng)基（SS瓊脂）及醋酸鉛試紙驗(yàn)證，野生株在 SS瓊脂上為黑色菌落，而ΔphsA突變株為無色菌落；野生株可使醋酸鉛試紙明顯變黑，

12、但是ΔphsA突變株卻不能。說明ΔphsA突變株無法利用培養(yǎng)基中的硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S，不能與指示劑反應(yīng)生成黑色沉淀。在不同抗生素種類（諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素）及過氧化氫刺激下，通過對(duì)野生株與ΔphsA突變株生長曲線的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)野生株的生長水平顯著高于ΔphsA突變株，表明野生株可利用其產(chǎn)生的H2S抵御抗生素的殺菌作用，從而耐藥生長。在抗生素或過氧化氫刺激下，野生株內(nèi)由氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生的ROS顯著低于ΔphsA突變株，說明

13、H2S可通過抑制抗生素氧化應(yīng)激過程中ROS的表達(dá)，發(fā)揮細(xì)菌保護(hù)作用，從而使細(xì)菌耐藥生長。
　　綜上所述，本研究通過開展對(duì)H2S陰性沙門菌抗生素耐藥性及耐藥機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)H2S陰性沙門菌與H2S陽性沙門菌耐藥性的差異；對(duì)H2S陰性沙門菌與H2S陽性沙門菌的遺傳多態(tài)性研究，首次發(fā)現(xiàn)了兩種H2S陰性沙門菌的ST型別，并且發(fā)現(xiàn)H2S陰性沙門菌形成了與H2S陽性沙門菌不同的進(jìn)化分支；對(duì)H2S參與沙門菌耐藥機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)H2S可利用其還原性